4個小麥抗旱相關轉錄因子基因的表達及其與抗旱生理生化指標的相關性

劉秉焱，韓翠英，劉虎岐

(西北農林科技大學 生命科學學院，陜西楊凌　712100)

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4個小麥抗旱相關轉錄因子基因的表達及其與抗旱生理生化指標的相關性

劉秉焱，韓翠英，劉虎岐

(西北農林科技大學 生命科學學院，陜西楊凌712100)

摘要篩選轉錄因子基因作為小麥抗旱性鑒定指標，豐富和補充小麥抗旱鑒定體系。以4個抗旱性不同的小麥品種為材料，通過實時熒光定量PCR，檢測4個抗旱相關轉錄因子基因( TaERF1 , TaMYB30, TaNAC69, Wabi5)在不同處理時間的表達，同時分析干旱脅迫下4個抗旱生理生化指標的變化，探究4個轉錄因子基因的表達與抗旱生理生化指標之間的相關性。結果表明，基因 TaERF1、 TaMYB30、 TaNAC69和 Wabi5的表達都受干旱脅迫的誘導，且在抗旱性不同的小麥品種中的表達模式存在明顯差異； 相關性分析表明， TaERF1在各脅迫持續時間點的表達量都與可溶性蛋白和丙二醛(MDA)呈顯著或極顯著相關，在脅迫處理3 h、24 h和48 h時， TaERF1的表達量與相對含水量(RWC)顯著相關， TaMYB30、 TaNAC69和 Wabi5在一定時段的干旱脅迫后的表達量也分別與可溶性糖、可溶性蛋白、RWC和MDA存在顯著相關性。說明轉錄因子基因 TaERF1、 TaMYB30、 TaNAC69和 Wabi5的表達可以作為評估小麥抗旱性的參考指標。

關鍵詞小麥；干旱抗性；轉錄因子；抗旱指標

干旱是影響農作物產量的主要非生物脅迫因子之一。選育抗旱性較強的作物品種是提高農作物產量的一個重要途徑，快速準確的對作物抗旱性進行鑒定是品種選育的關鍵。目前對小麥抗旱性的評價多從形態結構和生理生化水平著手，較少有直接從分子水平對小麥抗旱性評價的研究[1-2]。植物受到干旱脅迫以后，通過調節體內多個脅迫應答功能基因的表達來提高自身的耐脅迫能力[3]。轉錄因子作為調控因子，在干旱脅迫下的信號轉導及功能基因的表達中起著承上啟下的重要作用[3-4]。

研究表明，與干旱脅迫應答相關的轉錄因子多為AP2/ERF、MYB/MYC、NAC和bZIP類轉錄因子[5-6]。AP2/ERF類轉錄因子基因 TaERF1的表達在干旱脅迫后上調，將 TaERF1轉入擬南芥、小麥及煙草， TaERF1的超表達使多個脅迫應答相關基因的表達上調，顯著增強轉基因植株對滲透脅迫的抗性[7]。在干旱脅迫下，MYB類轉錄因子編碼基因 TaMYB30的表達上調，轉入 TaMYB30的擬南芥在發芽和幼苗階段對干旱的抗性顯著增強，一些與干旱脅迫應答相關基因的表達水平也發生了變化[8-9]。NAC類轉錄因子編碼基因 TaNAC69的表達水平也因干旱脅迫而顯著上調，超表達 TaNAC69的小麥植株中一些干旱脅迫誘導基因的表達被上調，轉基因植株的水分利用效率升高，抗旱性顯著增強[10-12]。 Wabi5是小麥中一個bZIP類轉錄因子編碼基因，其表達也因干旱脅迫而上調，轉 Wabi5基因煙草對干旱的耐受性顯著增強， Wabi5的表達使煙草中多個脅迫應答相關基因的表達增強，表明 Wabi5在干旱脅迫應答反應中發揮著重要作用[13]。

本研究通過測定干旱脅迫下小麥中轉錄因子基因 TaERF1、 TaMYB30、 TaNAC69和 Wabi5的表達及幾個常用生理生化指標的變化，進一步分析這些生理生化指標的變化與基因表達的相關性，以期從基因的角度著手，探討轉錄因子基因的表達分析作為小麥抗旱性鑒定指標的可行性，豐富和補充小麥抗旱鑒定體系，為小麥抗旱育種研究提供幫助。

1材料與方法

1.1材料與處理

以2個抗旱性較好的小麥品種‘普冰9946’和‘運旱805’，2個干旱敏感性品種‘西農979’和‘中麥895’為材料，小麥種子均來自西北農林科技大學農學院。

采用水培法，選取籽粒飽滿、大小一致的小麥種子，用自來水清洗2次，然后用φ=10%的次氯酸鈉溶液消毒15 min，再用蒸餾水清洗干凈。在培養皿的底部鋪2層濾紙，將種子均勻鋪于濾紙上，加蒸餾水使濾紙充分吸水浸濕，室溫暗室催芽約24 h。挑出不發芽的種子，將發芽一致的種子均勻擺在培養皿(d=200 mm)中，置于 25 ℃(光照16 h，黑暗8 h )培養箱中培養。小麥幼苗長至15 d時，向培養皿中加入15 mLw=20% PEG-6000溶液模擬干旱脅迫處理，同時設置水處理對照。

1.2生理生化指標的測定

分別采取對照組和PEG處理48 h的小麥幼苗整體葉片，測定4個耐旱生理生化指標，每組3個重復，每次做3個平行反應。相對水分含量(RWC)= (鮮質量-干質量)/(飽和質量-干質量) ×100%[14]。丙二醛(MDA)摩爾質量濃度測定采用硫代巴比妥酸比色法[15]。可溶性糖質量濃度測定采用蒽酮比色法[16]。可溶性蛋白質量濃度測定采用考馬斯亮藍G250比色法[17]。

1.3實時熒光定量PCR

分別在PEG處理3、6、12、24和48 h時取小麥幼苗葉片并提取RNA，分析轉錄因子基因的表達量。采用Trizol試劑(TaKaRa公司)提取小麥幼苗葉片總RNA，經超微量紫外分光光度計檢測和瓊脂糖凝膠電泳檢測，確定RNA的純度及完整性，用HiScriptTMQRT SuperMix for qPCR (+ gDNA wiper)試劑盒進行反轉錄，合成cDNA。

運用軟件Primer premier 5.0，分別設計各基因的特異性引物(表1)，引物由上海生工生物工程技術服務有限公司合成。

表1　候選基因及其引物

實時熒光定量PCR擴增用AceQTMqPCR SYBR○RGreen Master Mix試劑盒，以基因β-actin為內參，在CFX96型實時定量PCR儀(Bio-Rad公司)上進行，每個樣品重復3次，且每次做3個平行反應。實時熒光定量PCR反應體系(10 μL)為cDNA模板1 μL，AceQTMqPCR SYBR○RGreen Master Mix 5 μL，上下游引物各0.2 μL (10 μmol/L)，滅菌超純水3.6 μL。PCR擴增程序如下：95 ℃ 5 min；95 ℃ 10 s，61 ℃ 30 s,40個循環；反應結束后65 ℃ 5 s，并以0.5℃/s的速度升至95 ℃進行溶解曲線分析。

1.4數據統計分析

用Microsoft Excel 2007和SPSS軟件進行生理生化指標數據分析。以對照組各指標的測定值為參照，以PEG處理持續48 h后的測定值與對照組的比值作為各生理生化指標的相對變化，并用SPSS軟件分析各指標相對變化之間的相關性。

用CFX Manager軟件及Microsoft Excel 2007，按2-△△Ct法[18]計算目標基因的相對表達量。用SPSS軟件分析不同處理持續時間下各基因的相對表達量與各生理生化指標的相對變化之間的相關性。

2結果與分析

2.1不同品種小麥抗旱生理生化指標差異分析

測定對照組及PEG處理持續48 h的各品種小麥的4種生理生化指標(表2)，PEG處理后的小麥中4種生理生化指標與對照組都具有顯著差異。計算脅迫48 h后各指標的相對變化(表3)，結果發現4個生理生化指標的相對變化在抗旱性不同的小麥品種間都存在顯著差異。2個抗旱性品種葉片中可溶性糖和可溶性蛋白的相對變化均大于2個干旱敏感性品種，可溶性糖在‘普冰9946’中的相對變化最大，為1.96，是最小的‘西農979’的1.4倍。可溶性蛋白相對變化最大的品種‘運旱805’是相對變化最小的品種‘中麥895’的1.5倍。MDA在2個干旱敏感性的品種中的相對變化均大于2個抗旱性品種。RWC在2個干旱敏感性品種中的變化也較大。

表2　4種材料對照組和干旱脅迫48 h后的生理指標)

表3　干旱脅迫48 h后各個抗旱生理生化指標的相對變化)

相關性分析(表4)表明，PEG處理以后，可溶性蛋白的相對變化與MDA的相對變化呈負相關(r= -0.986，P<0.05)， 與相對含水量的相對變化呈正相關(r= 0.974，P<0.05)。MDA的相對變化與相對含水量的相對變化呈負相關(r= -0.985，P<0.05)。而可溶性糖與可溶性蛋白，MDA和RWC間的相關性不顯著。

2.2各轉錄因子基因在不同品種小麥中的表達模式分析

4個轉錄因子基因在不同品種的小麥中的表達模式如圖1所示。PEG處理下， TaERF1在4個品種的小麥中具有相似的表達模式，都表現出上升-下降-再上升-再下降的模式。第1個表達峰值都位于3 h時，之后逐漸降低，12 h時為最低。24 h時，基因 TaERF1的相對表達量再次升高，達到第2個表達峰值。2個抗旱性品種小麥中基因 TaERF1的表達水平明顯高于2個干旱敏感性品種，3 h和24 h時，基因 TaERF1在‘普冰9946’中的相對表達量分別為3.39和3.67，在‘運旱805’中分別為3.53和3.92，而在‘西農979’中為2.04和 1.73，‘中麥895’中為1.87和1.52。

PEG處理下，各品種的小麥幼苗中 TaMYB30的表達水平都上調了，且在各品種中隨脅迫處理時間都呈現出上升-下降-上升的表達模式。但在2個抗旱性品種中 TaMYB30表達的誘導明顯比2個干旱敏感性品種快而強， 3 h時2個抗旱性品種中的相對表達量即達到最大，‘普冰9946’中為4.75，‘運旱805’中為3.71，而2個干旱敏感性品種中， 6 h時才達到最大相對表達量，‘西農979’中為3.00，‘中麥895’中為2.21。

表4　各個抗旱生理生化指標相對變化之間的相關性

注：*和**分別表示相關性達顯著(P<0.05)和極顯著(P<0.01)水平 。表5同。

Note： * and ** indicate significant correlation (P<0.05) and very significant (P<0.01) respectively. The same as in table 5.

圖1　轉錄因子基因 TaERF1 (A)、 TaMYB30 (B)、

PEG處理下， TaNAC69在抗旱性品種和干旱敏感性品種中的表達模式有所不同。在2個抗旱性品種中，3 h時 TaNAC69的表達量與對照組相比基本相等，6 h時其表達量有所下降，6 h以后，其表達量逐漸上升，48 h時都達到對照組的2倍以上；而在2個干旱敏感性品種中， 3 h時 TaNAC69的表達量都顯著低于對照組，3 h以后表達量逐漸持續上升，48 h時其表達量顯著高于對照組，‘西農979’ 中相對表達量為1.39，‘中麥895’中的相對表達量達到了1.58。

PEG處理下， Wabi5在不同品種小麥中的表達模式也不同。在2個抗旱性品種中， Wabi5都被快速誘導表達，3 h時表達水平即達到最高，之后逐漸下降并最終達到與對照組基本相同的水平。而在2個干旱敏感性品種中， Wabi5表達的誘導較慢， 6 h時表達量達到最高值，之后逐漸下降，‘中麥895’最終基本恢復到對照的水平，而‘西農979’中的表達量下降較快，12 h時顯著低于對照組，24 h時有所回升，48 h再次下降，最終低于對照。PEG處理誘導后，抗旱品種‘普冰9946’中 Wabi5的表達量顯著高于其他品種。

2.3各轉錄因子基因的相對表達量與生理生化指標相對變化的相關性分析

將4個轉錄因子基因的相對表達量與所測4個生理生化指標的相對變化進行相關性分析(表5)。 TaERF1在PEG處理3 h、24 h 和48 h時的相對表達量與可溶性蛋白的相對變化呈極顯著相關，6 h呈顯著相關；在脅迫3 h、6 h、12 h、24 h和48 h時的相對表達量與MDA的相對變化呈顯著相關，說明 TaERF1的表達與可溶性蛋白和MDA具有非常密切的關系。 TaERF1在脅迫3 h、24 h和48 h時的相對表達量與RWC顯著相關，而其在各個脅迫時間點的相對表達量與可溶性糖相對變化的相關性都不顯著，說明轉錄因子 TaERF1可能沒有參與有關糖代謝的調控。 TaMYB30 在PEG處理3 h時的相對表達量與RWC的相對變化顯著相關，48 h與可溶性蛋白的相對變化顯著相關。 TaNAC69在PEG處理后3 h的相對表達量與可溶性糖的相對變化顯著相關，12 h的相對表達量與可溶性蛋白和MDA的相對變化顯著相關，24 h的相對表達量與可溶性蛋白的相對變化顯著相關，48 h的相對表達量與可溶性糖的相對變化顯著相關。 Wabi5在PEG處理3 h的相對表達量與可溶性糖的相對變化顯著相關，12 h的相對表達量與可溶性糖的相對變化極顯著相關，說明轉錄因子 Wabi5可能參與有關糖代謝的調控。

表5　轉錄因子基因相對表達量與生理生化指標相對變化的相關性

3討 論

3.1各轉錄因子基因的表達受干旱脅迫誘導

轉錄因子在干旱脅迫信號的轉導和功能基因的表達中具有極其重要的調控作用。一個轉錄因子可能調控多個功能基因的表達[19-20]，說明轉錄因子往往作用于干旱脅迫信號轉導和調控網絡的關鍵節點。本研究中各基因的表達出現上下波動的模式，特別是 TaERF1和 Wabi5的表達量表現為上升-下降-再上升-再下降的模式。有報道表明一般mRNA的表達都為脈沖型[21]，因此，上下波動表達也應該為一種正確的基因表達類型。通過比較4個轉錄因子基因 TaERF1、 TaMYB30、 TaNAC69和 Wabi5在4個不同品種的小麥幼苗葉片中相對表達量變化發現，在PEG處理處理下，各個基因的表達水平都不同程度被上調，這與前人的研究結果一致[7-13]，也說明這4個轉錄因子在小麥對干旱脅迫的應答中發揮重要作用；同時，據此推測轉錄因子 TaERF1、 TaMYB30、 TaNAC69和 Wabi5在小麥干旱脅迫應答中起正調控的作用。

3.24個轉錄因子基因在不同小麥中的表達模式存在差異

根據信號傳遞過程是否需要脫落酸(ABA)的參與,植物的干旱脅迫信號轉導途徑分為ABA依賴性途徑和非ABA依賴性途徑兩類[22]。不同的信號轉導途徑在發揮的作用和響應的時間上都不同[23]。轉錄因子 TaERF1、 TaNAC69和 Wabi5為ABA依賴性信號轉導途徑中的調節因子[7,10,13]，而 TaMYB30為非ABA依賴性信號轉導途徑中的調節因子[8-9]。本試驗結果中，各個基因在不同品種的小麥中的表達水平和誘導模式都存在差異，其原因可能是每個基因所參與的信號轉導通路不同，并且不同品種的小麥應答干旱脅迫的機制存在差異。與干旱敏感性小麥相比，2個抗旱性品種小麥的幼苗葉片中基因 TaERF1、 TaMYB30、 TaNAC69和 Wabi5的表達受干旱脅迫的誘導更為明顯。進一步表明這些轉錄因子可能參與小麥干旱脅迫應答反應。

3.3各轉錄因子基因的表達與生理生化指標的相關性

植物受到干旱脅迫以后，體內產生的活性氧會將細胞膜過氧化而產生MDA，所以MDA指標直接反映細胞膜的損傷程度；植物體內一些清除活性氧的酶含量的增加，能夠減輕活性氧對細胞膜的傷害；干旱脅迫下，植物體內可溶性蛋白、可溶性糖等高親水性分子的積累可以防止細胞水分流失[24]。同時，LEA蛋白等可溶性蛋白具有穩定細胞膜結構，作為分子伴侶結合離子和防止氧化等作用[25]。本研究中，可溶性蛋白的相對變化與MDA的相對變化顯著負相關，與RWC的相對變化顯著相關，與上述理論一致。 TaERF1的相對表達量與可溶性蛋白相對變化的相關性除了在12 h不顯著外，其余各個脅迫持續時段都呈顯著或極顯著， TaERF1在各個脅迫持續時段的相對表達量與MDA的相對變化都呈顯著負相關，同時，3、24和48 h的相對表達量與RWC的相對變化顯著相關，表明轉錄因子 TaERF1可能參與調控可溶性蛋白及活性氧清除相關的酶表達量對干旱脅迫的植物進行保護，提高植物的抗旱能力。 TaMYB30的相對表達量和RWC的相對變化顯著相關，與可溶性蛋白相對變化顯著負相關，說明轉錄因子 TaMYB30可能參與調控可溶性蛋白的積累而提高小麥的保水能力。 TaNAC69的相對表達與可溶性糖和可溶性蛋白的相對變化顯著相關，與MDA的相對變化顯著負相關，表明干旱脅迫下， TaNAC69可調控可溶性糖和可溶性蛋白等溶質的積累，對細胞膜產生保護作用。 Wabi5的相對表達與可溶性糖的相對變化顯著或極顯著相關，反映 Wabi5可能參與調節可溶性糖的積累，提高小麥耐旱性。

總之，轉錄因子基因 TaERF1 、 TaMYB30、 TaNAC69 和 Wabi5的表達與小麥干旱脅迫應答反應具有密切的關系，在小麥幼苗葉片中的表達均有上調，且在抗旱性品種‘普冰9946’和‘運旱805’中的表達量比干旱敏感性品種‘西農979’和‘中麥895’中高。可溶性蛋白、可溶性糖、RWC和MDA是評價植物抗旱性的常用指標[13]，而在本研究中， TaERF1在各個時段的表達與可溶性蛋白和RWC有顯著或極顯著相關性，與MDA顯著負相關； TaMYB30、 TaNAC69 和 Wabi5在一定時間的干旱脅迫下的表達量也分別與可溶性蛋白、可溶性糖、RWC和MDA存在顯著相關性，因此，在評估小麥的抗旱性時，可以將基因 TaERF1 、 TaMYB30、 TaNAC69 和 Wabi5的表達情況作為參考指標。

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Received 2015-03-02Returned2015-04-04

Foundation itemYouth Academic Backbone Research Foundation of Northwest A&F University (No. 01140302).

First author LIU Bingyan,male,master.Research area:molecular biology of plant stress resistance. E-mail:327883242@qq.com

(責任編輯：成敏Responsible editor:CHENG Min)

Correlation between Expression of Drought-related Transcription Factor Genes and PhysiologicalBiochemical Indexes in Wheat

LIU Bingyan,HAN Cuiying and LIU Huqi

(College of Life Sciences,Northwest A&F University,Yangling Shaanxi712100,China)

AbstractThis paper aims at screening transcription factor genes as indexes of identification of wheat drought resistance,enriching and complementing the identification system of current wheat drought resistance . Correlation between expression of transcription factor genes and four physiological and biochemical indexes was investigated under drought stress using four varieties of wheat. The genes include four drought-related transcription factor genes ( TaERF1 , TaMYB30, TaNAC69, Wabi5 ). The results showed that the expression of TaERF1 , TaMYB30, TaNAC69, Wabi5 were induced by drought stress,and the expression profiles were different among the genes between drought tolerant wheat and drought sensitive wheat. Correlation analysis showed that the expression of TaERF1 was significantly correlated to soluble protein and malonaldehyde (MDA) during drought stress,it also correlated to relative water content (RWC) after 3 h,24 h and 48 h of drought. The expression of TaMYB30, TaNAC69, Wabi5 after some certain time also had significant correlation with soluble protein,soluble sugar,RWC and MDA. The results indicated that the expression of TaERF1, TaMYB30, TaNAC69 and Wabi5 could be appraisal indexes of drought-tolerance of wheat.

Key wordsWheat; Drought-resistance; Transcription factor; Drought-resistance index

收稿日期：2015-03-02修回日期：2015-04-04

基金項目：西北農林科技大學青年學術骨干研究基金(01140302)。

通信作者：劉虎岐，男，副教授，博士，碩士生導師，主要從事植物分子遺傳學、植物干旱抗性及植物發育生物學研究。E-mail:liuhuqi@nwsuaf.edu.cn

中圖分類號S332.1

文獻標志碼A

文章編號1004-1389(2016)04-0530-08

Corresponding authorLIU Huqi,male,associate professor,Ph.D,master instructor.Research area:plant molecular genetics,plant drought resistance and plant developmental biology. E-mail: liuhuqi@nwsuaf.edu.cn

網絡出版日期：2016-04-02

網絡出版地址：http://www.cnki.net/kcms/detail/61.1220.S.20160402.1112.016.html

第一作者：劉秉焱，男，碩士，從事植物抗逆分子生物學研究。E-mail: 327883242@qq.com