腦脊液細胞學檢查在隱球菌性腦膜炎診斷中的應用

柳曉金，張　志，許　怡，梅志勤，葉立紅，張海叢

(石家莊市第五醫院　檢驗科，河北　石家莊　050000)

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腦脊液細胞學檢查在隱球菌性腦膜炎診斷中的應用

柳曉金，張志，許怡，梅志勤，葉立紅，張海叢

(石家莊市第五醫院檢驗科，河北石家莊050000)

【摘要】目的：探討腦脊液細胞學檢查在隱球菌性腦膜炎早期診斷中的應用價值。方法：對25例經病原學確診的隱球菌性腦膜炎患者進行回顧性分析。結果：25例隱球菌性腦膜炎患者入院前有20例被誤診，其中誤診為結核性腦膜炎15例。采用腦脊液細胞學瑞吉染色法、直接涂片墨汁染色法、離心涂片墨汁染色法和培養法4種方法首次的陽性率分別為88%、48%、72%和40%；治療后18例好轉，3例惡化，4例死亡。經統計學比較，4組陽性率不完全相同(χ2=15.45，P=0.001)。其中，腦脊液細胞學瑞吉染色法與直接涂片墨汁染色法比較有統計學意義，與離心涂片墨汁染色法比較無統計學意義。結論：隱球菌性腦膜炎的誤診率高，腦脊液細胞學技術首次病原學檢測陽性率最高。另外，該技術還可評估患者的免疫反應狀態，值得臨床推廣應用。

【關鍵詞】隱球菌性腦膜炎；腦脊液細胞學；墨汁染色

【DOI】10.3969/j.issn.1002-0217.2016.01.015

隱球菌性腦膜炎是由新型隱球菌及其變種引起的中樞神經系統感染性疾病，臨床表現、腦脊液常規檢查及影像學檢查缺乏特異性，診斷困難，預后差，即使經過正規治療其病死率仍在20%～30%。為了提高其診斷水平，現將25例隱球菌性腦膜炎患者應用腦脊液細胞學及其他實驗技術的情況進行回顧性分析，現報道如下。

1資料與方法

1.1一般資料25個病例均來自2010年1月～2014年12月本院住院患者，男15例，女10例，年齡23～79歲，確診時間18天～1年不等。有養鴿史3例；合并其他免疫低下基礎疾病或長期應用激素等情況19例：耐藥肺結核3例，干燥綜合征2例，系統性紅斑狼瘡3例，慢性肝病5例，糖尿病4例，慢性腎炎1例，慢性支氣管炎1例；其余3例無特殊接觸史和病史。

1.2臨床表現亞急性起病21例，急性起病4例；頭痛、惡心、嘔吐20例；視乳頭水腫10例；視力下降8例；視神經萎縮2例；意識障礙7例；聽力下降3例；雙下肢無力3例；Babinski征陽性2例；腦膜刺激征陽性22例。

1.3誤診情況誤診20例，其中誤診為結核性腦膜炎15例，化膿性腦膜炎2例，病毒性腦膜炎2例，神經炎l例。

1.4儀器和試劑細胞玻片沉淀儀(Thermo Fisher Cytospin-4型)；瑞吉染液(珠海貝索生物技術有限公司)；顯微鏡(奧林巴斯CX22)；BACTEC9120全自動血培養儀(美國BD公司)。

1.5病原檢測方法

1.5.1腦脊液細胞學瑞吉染色法取腦脊液0.5 mL加入到細胞玻片離心沉淀儀，離心5 min(500 r/min)，待玻片干燥后行瑞吉染色，鏡檢。結果判讀：隱球菌常成堆，成簇排列，為紫黑色，菌體周圍呈針刺樣輻射。

1.5.2直接涂片墨汁染色法取一滴腦脊液滴于干凈玻片上，滴一滴墨汁覆蓋腦脊液，緩慢蓋上蓋玻片后在顯微鏡下觀察。結果判讀：可見黑色背景下透亮的菌體及莢膜，菌體多呈圓形，多散在分布。

1.5.3離心涂片墨汁染色法取腦脊液1～3 mL離心15 min(3000 r/min)，棄去上清，取沉淀物一滴于載玻片上，加墨汁與腦脊液的比例為1∶3，鏡檢，在黑色背景下可見到透亮的菌體和寬厚莢膜。結果判讀：可見黑色背景下透亮的菌體及莢膜，菌體呈圓形，多成堆分布。

1.5.4培養法將無菌腦脊液注入血培養瓶中，在BACTEC 9120全自動血培養儀內培養，陽性培養瓶立即轉種沙保羅培養基，生長并分純后用真菌鑒定試劑條API20C AUX鑒定。

1.6統計學方法所得數據均錄入SPSS 19.0統計軟件，計數資料采用卡方檢驗，P<0.05為差異有統計學意義。

2結果

2.14種方法的陽性率及腦脊液細胞學表現25例患者腦脊液細胞學瑞吉染色法、直接涂片墨汁染色法、離心涂片墨汁染色法及培養法4種方法首次的陽性率分別為88%(22/25)、48%(12/25)、72%(18/25)和40%(10/25)。在隱球菌性腦膜炎早期，腦脊液細胞學瑞吉染色法可以發現成堆的隱球菌(圖1A)，隨著疾病的轉歸，可發現隱球菌的數量逐漸減少，并且可以看到隱球菌吞噬細胞(圖1B)、嗜酸性粒細胞(圖1C)。

A.成堆分布的隱球菌；B.隱球菌吞噬細胞；C.嗜酸性粒細胞。

圖1腦脊液細胞學表現(瑞吉染色法×100)

2.24種方法陽性率的統計學分析4種方法陽性率經統計學比較不全相同(表1)。其中3種快速診斷法中，腦脊液細胞學瑞吉染色法陽性率88%，明顯高于直接涂片墨汁染色法，差異有統計學意義(P<0.05)；離心涂片墨汁染色法陽性率72%，與腦脊液細胞學瑞吉染色法陽性率比較，差異無統計學意義(P>0.05)。

表14種方法檢測結果比較

檢測方法陽性陰性合計χ2值P值腦脊液細胞學瑞吉染色法2232515.450.001直接涂片墨汁染色法121325離心涂片墨汁染色法18725培養法101525

2.3治療及預后25例患者全部應用氟康唑靜脈注射治療，其中對于病情較重者加用鞘內注射兩性霉素B和(或)氟美松。治療后好轉18例，惡化3例，死亡4例。

3討論

隱球菌是具有莢膜的真菌，廣泛存在于自然界中，其為條件致病菌，主要經呼吸道傳播，當宿主免疫功能低下時經血流播散到中樞神經系統引起隱球菌性腦膜炎。近年來隨著廣譜抗生素、糖皮質激素、免疫抑制劑、腫瘤放化療的廣泛應用和艾滋病患者的增多，隱球菌性腦膜炎患者隨之明顯增多。

在腦脊液中找到隱球菌是隱球菌性腦膜炎確診的依據，隱球菌性腦膜炎的療效和轉歸很大程度上取決于早期明確診斷[2-3]。常用的診斷方法敏感性低，由于不能及時診斷而延誤治療，導致病死率及致殘率居高不下。直接涂片墨汁染色是傳統的檢測方法，其操作簡單、迅速，但在發病的早期，鏡檢常無異常，誤診率在90%左右，常需反復多次送檢才能得到陽性結果。其原因主要是疾病早期隱球菌密度低；直接涂片墨汁染色不均勻，整個視野漆黑，雜質、氣泡等也呈透光現象，若檢驗人員對隱球菌識別經驗不足，可能把白細胞誤認為是隱球菌；這些原因使得墨汁染色法檢出隱球菌的效率很低。本研究直接涂片墨汁染色陽性率為48%，與文獻報道的43.4%比較一致。離心涂片墨汁染色可以起到濃縮隱球菌的作用，提高了陽性率，但所用標本量大，離心后轉移沉淀過程中會造成菌的部分丟失，上述的墨汁染色法的缺點仍然存在，若腦脊液中含隱球菌含量較少，高倍鏡檢測也易導致菌的漏檢。隱球菌培養方法所需時間長，不能做到及時診斷，陽性率也不高。Antionori等報道腦脊液中隱球菌抗原檢測的陽性率為94.1%，但是高濃度隱球菌抗原所致的鉤帶現象和體內未知非特異性蛋白對隱球菌抗原的掩蓋效應,可引起假陰性，結核患者血清可引起隱球菌莢膜多糖抗原乳膠凝集試驗假陽性，假陰性、假陽性的問題無法解決。

腦脊液細胞學瑞吉染色法利用玻片離心沉淀法收集隱球菌，所用標本只需0.5 mL，隱球菌一次性沉淀在玻片上，幾乎沒有任何損失，染色后在油鏡下十分清晰地觀察到隱球菌的特殊形態，特異性極高。 有研究顯示，腦脊液細胞學首次發現隱球菌的檢出率95.8%。本研究腦脊液細胞學瑞吉染色法首次檢出率為88%，與常用的直接墨汁染色法比較，差異有統計學意義，與文獻報道也較一致。腦脊液細胞學瑞吉染色法與離心涂片墨汁染色法首次檢查率沒有統計學意義，其原因可能是標本例數較少，需擴大樣本量進行深入研究，但從其他方面來看，細胞學技術更具優勢：經有效治療后，隨著疾病的轉歸，細胞學可以觀察到中性粒細胞比例減少，淋巴細胞所占比例增多，白細胞對隱球菌的吞噬情況，以及象征慢性炎癥反應的嗜酸性粒細胞，隱球菌數目減少直至消失。此技術可以詳細評估患者的免疫反應狀態和治療效果，而離心涂片墨汁染色對于病情的評估只能看到隱球菌的多少，在非染色的情況下用高倍鏡觀察不能分辨白細胞的類別，更不能觀察到吞噬等情況，隨著病情轉歸隱球菌數量越來越少，其檢出效率也會降低。

由于醫生對隱球菌性腦膜炎認識不足，其起病和其他腦膜炎沒有絕對的特異性，腦脊液生化檢查和結核性腦膜炎十分相似，誤診誤治為結核性腦膜炎的情況時有發生。本組患者整體誤診率為80%，大多數誤診為結核性腦膜炎。有1例患者起病時以視力受損為主要表現，一直被誤診為視神經炎，直至患者失明、昏迷才考慮到神經系統感染。對于原有基礎疾病，體質差、長期應用激素和抗生素的患者，一旦出現顱壓高、頭痛、視力減退等情況要警惕隱球菌性腦膜炎可能，及時進行多次的病原學檢查。隱球菌性腦膜炎早期診斷困難，敏感而特異的病原學檢測手段可提高其診斷率，有利于及時治療，從而降低病死率和致殘率?？傊?，腦脊液細胞學檢查在隱球菌性腦膜炎的診斷和治療評估方面意義重大，值得臨床推廣應用。

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Significance of cytological examination in detecting Cryptococcus neoformans meningitis

LIU Xiaojin,ZHANG Zhi,XU Yi,MEI Zhiqin,YE Lihong,ZHANG Haicong

Clinical Laboratory,Shijiazhuang No.5 Hospital,Shijiazhuang 050000,China

【Abstract】Objective：To assess the value of cerebrospinal fluid cytological examination in early diagnosis of Cryptococcus neoformans meningitis.Methods:Clinical presentations and positive rates by different four techniques in detecting Cryptococcus neoformans meningitis were retrospectively analyzed in 25 cases.Results:Of the 25 cases,20 were misdiagnosed prior to admission,in which 15 were misdiagnosed as tuberculous meningitis.The positive rates of Wright-Giemsa staining of the cerebrospinal fluid,direct India-ink capsule staining of the smear and centrifugation of the smear as well as fungal culture of the cerebrospinal fluid were 88%,48%,72% and 40%,respectively,which were statistically different(χ2=15.45,P=0.001).The difference was significant between Wright-Giemsa staining of the cerebrospinal fluid and direct India-ink capsule staining of the smear,yet was not as compared to centrifugal smear.In 25 cases,18 improved,3 worsened,and 4 died.Conclusion:Misdiagnosis commonly exist in Cryptococcus neoformans meningitis.However,cerebrospinal fluid cytology may demonstrate higher positive rate for Cryptococcus neoformans in initial examination,and be also used to estimate immune state for the patients,suggesting that this technique be worthy of wider clinical recommendations.

【Keywords】Cryptococcus neoformans,meningitis;cerebrospinal fluid,cytology;India-ink staining

文章編號：·臨床醫學·1002-0217(2016)01-0051-03

基金項目：河北省醫學科學研究重點課題計劃(20150894)

收稿日期：2015-07-24

作者簡介：柳曉金(1983-)，女，主治醫師，(電話)18031263235，(電子信箱)liu_kimxiaojin@sina.com；

【文獻標識碼】【中圖號】R 519.4A

張海叢，女，主治醫師，(電子信箱)63688873@qq.com，通訊作者.