改進(jìn)HPLC法測(cè)定人血清中丙戊酸鈉的濃度

沈陳軍，陳新貴，王　勇，胡秀萍

(滁州市第一人民醫(yī)院　藥劑科臨床藥學(xué)室，安徽　滁州　239000)

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改進(jìn)HPLC法測(cè)定人血清中丙戊酸鈉的濃度

沈陳軍，陳新貴，王勇，胡秀萍

(滁州市第一人民醫(yī)院藥劑科臨床藥學(xué)室，安徽滁州239000)

【摘要】目的：建立改進(jìn)HPLC法測(cè)定人血清中丙戊酸鈉的濃度，為臨床合理使用丙戊酸鈉提供依據(jù)。方法：環(huán)己烷羧酸作為內(nèi)標(biāo)，血樣經(jīng)硫酸酸化和蛋白沉淀，用正己烷提取后，與2-溴苯乙酮和三乙胺催化衍生，使用HPLC進(jìn)行測(cè)定。色譜柱：ZORBAX SB-C18柱(150 mm×4.6 mm，5 μm)；流動(dòng)相：甲醇-水(72∶28)；流速：1.0 mL/min；紫外檢測(cè)波長(zhǎng)：248 nm；柱溫：25℃；進(jìn)樣量：10 μL。結(jié)果：血清中丙戊酸鈉線性范圍13.3～160.7 μg/mL(r=0.9979，n=6)，血清丙戊酸鈉低、中、高濃度方法回收率和萃取回收率分別為88.6%～107.2%和82.1%～89.5%，日內(nèi)精密度≤6.4%，日間精密度≤8.2%。結(jié)論：本實(shí)驗(yàn)改進(jìn)后的方法特異性強(qiáng)、準(zhǔn)確度高、線性關(guān)系良好、節(jié)約實(shí)驗(yàn)室成本等，可適用于臨床丙戊酸鈉常規(guī)血藥濃度監(jiān)測(cè)的需求。

【關(guān)鍵詞】HPLC；丙戊酸鈉；血藥濃度；藥動(dòng)學(xué)

【DOI】10.3969/j.issn.1002-0217.2016.01.006

丙戊酸鈉又叫二丙基乙酸鈉，是臨床上常用的抗癲癇藥，但其副作用明顯，其中較嚴(yán)重的是導(dǎo)致血液系統(tǒng)損害和肝腎功能的異常等。由于使用量大，在臨床上常有不良反應(yīng)事件的發(fā)生。丙戊酸鈉有效血藥濃度在50～100 μg/mL之間，由于給藥劑量和其體內(nèi)過程與療效有較大差異，并且其劑量與藥效的相關(guān)度明顯小于血藥濃度與藥效的相關(guān)度，因此對(duì)丙戊酸鈉進(jìn)行臨床常規(guī)血藥濃度監(jiān)測(cè)是很有必要的。目前丙戊酸鈉血藥濃度檢測(cè)采用免疫法和HPLC法，對(duì)已發(fā)表的大量HPLC法測(cè)定丙戊酸鈉血藥濃度的文獻(xiàn)進(jìn)行分析和實(shí)驗(yàn)室驗(yàn)證發(fā)現(xiàn)，存在如下問題[4-5]：色譜條件選擇差異大，應(yīng)遵循色譜結(jié)果最佳且節(jié)約試劑的目的；萃取提取劑選擇不一，其中乙醚揮發(fā)性大并且有毒；衍生催化劑三乙胺加入量不統(tǒng)一，且相應(yīng)實(shí)驗(yàn)結(jié)果有較大差異；水浴衍生過程闡述不明，如水浴溫度、時(shí)間、水浴后萃取劑揮發(fā)方法不明等。因此通過改進(jìn)現(xiàn)有實(shí)驗(yàn)室條件和方法，本實(shí)驗(yàn)室建立了用硫酸酸化，正己烷萃取，三乙胺催化，2-溴苯乙酮衍生化和HPLC檢測(cè)的實(shí)驗(yàn)方法，且此方法準(zhǔn)確、重復(fù)性好，可滿足臨床丙戊酸鈉血藥濃度測(cè)定的需求。

1材料

1.1儀器Agilent 1260型高效液相色譜儀(美國(guó)Agilent公司)，包括DAD紫外檢測(cè)器和自動(dòng)進(jìn)樣器；XW-80A旋渦混合器(上海精科實(shí)業(yè)有限公司)；TDZ5-WS低速多管自動(dòng)平衡離心機(jī)、TG16-W高速離心機(jī)(長(zhǎng)沙維爾康湘鷹離心機(jī)有限公司)；FA-2004電子天平(常州天之平儀器設(shè)備有限公司)；DCY-24S氮吹儀(青島海科儀器有限公司)；SK40-120小型超聲清洗機(jī)(張家港市神科超聲電子有限公司)。

1.2試劑丙戊酸鈉(美國(guó)Sigma公司，批號(hào)：WXBB4060V)；2-溴苯乙酮(美國(guó)aladdin公司，批號(hào)：J1222026)；環(huán)己烷羧酸(美國(guó)aladdin公司，批號(hào)：J1323025)；正己烷、甲醇、乙腈(天津科密歐試劑公司)均為色譜純；三乙胺；濃氨水；濃硫酸均為分析純；超純水(院檢驗(yàn)科提供)；空白血清(院檢驗(yàn)科提供)。

2方法與結(jié)果

2.1色譜條件色譜柱：ZORBAX SB-C18柱(150 mm×4.6 mm，5 μm)；流動(dòng)相：甲醇∶水=72∶28；檢測(cè)波長(zhǎng)：248 nm；流速：1.0 mL/min；柱溫：25℃；進(jìn)樣量：10 μL；工作站：Agilent ChemStation。

2.2溶液配制

2.2.1丙戊酸鈉儲(chǔ)備液精密稱取丙戊酸鈉106.5mg至50 mL容量瓶中，加甲醇至刻度，制得2.134mg/mL的丙戊酸鈉儲(chǔ)備溶液。利用制備的丙戊酸鈉儲(chǔ)備液加入甲醇配制得1.607mg/mL、1.067mg/mL、0.803mg/mL、0.534mg/mL、0.267mg/mL、0.133mg/mL的丙戊酸鈉各濃度標(biāo)準(zhǔn)品溶液。

2.2.2內(nèi)標(biāo)物稱取環(huán)己烷羧酸50mg至100 mL容量瓶中，加0.2 mol/L的氨水稀釋至刻度，再精密吸取該溶液7.5 mL至25 mL容量瓶中，加0.5 mol/L的氨水甲醇稀釋至刻度，得到150 μg/mL的環(huán)己烷羧酸內(nèi)標(biāo)液。

2.2.3衍生化試劑精密稱取2-溴苯乙酮1.0 g置于25 mL棕色容量瓶中，加乙腈定容，得40mg/mL的2-溴苯乙酮乙腈溶液。

2.2.4氨水與酸化試劑0.2 mol/L氨水配制：取濃氨水1.5 mL至100 mL的容量瓶中，加水至刻度。0.5 mol/L氨水甲醇配制：取濃氨水3.87 mL至100 mL容量瓶中，加甲醇至刻度，即得。1 mol/L硫酸配制：精密稱取濃硫酸9.81 g，置于100 mL容量瓶中，加水稀釋至刻度，即得。以上各試劑制備后置于4℃冰箱中保存。

2.3血樣處理血液樣品經(jīng)3800 r/min離心5 min，取血清100 μl于離心管中，加環(huán)己烷羧酸內(nèi)標(biāo)液50 μL、硫酸50 μL，混勻1 min，加正己烷500 μL振蕩混勻2 min，然后以5000 r/min離心5 min，取上清液有機(jī)相于干凈的離心管中，下層液再加500 μL正己烷振蕩混勻2 min，再次以5000 r/min離心5 min，合并兩次上清有機(jī)相，加2-溴苯乙酮10 μL、三乙胺20 μL，振蕩混勻2 min，于55℃水浴15 min后通氮?dú)獠⒗^續(xù)水浴直至揮干溶劑，用甲醇100 μL溶解殘?jiān)袷幓靹? min，再以10 000 r/min離心5 min，取上清10 μL進(jìn)樣。

2.4特異性實(shí)驗(yàn)

2.4.1空白血清取健康人的空白血清100 μL置于離心管，然后按照步驟2.3進(jìn)行處理，得色譜圖A。

2.4.2空白血清+丙戊酸鈉標(biāo)準(zhǔn)品+內(nèi)標(biāo)物取健康人的空白血清100 μL置于離心管中，加丙戊酸鈉標(biāo)準(zhǔn)品10 μL，環(huán)己烷羧酸內(nèi)標(biāo)液50 μL，然后按照步驟2.3進(jìn)行處理，得色譜圖B。

2.4.3樣品血清+內(nèi)標(biāo)物取服用丙戊酸鈉患者的血清100 μL置于離心管中，然后按照步驟2.3進(jìn)行處理，得色譜圖C。

A.空白血清；B.空白血清+丙戊酸鈉標(biāo)準(zhǔn)品+內(nèi)標(biāo)物；C.樣品血清+內(nèi)標(biāo)物；1．環(huán)己烷羧酸(內(nèi)標(biāo)物)；2.丙戊酸鈉。

圖1丙戊酸鈉特異性HPLC色譜圖

2.5標(biāo)準(zhǔn)曲線制備取6支2.0 mL離心管，分別加入100 μL健康人空白血清，加入2.2.1中制備的不同濃度的丙戊酸鈉標(biāo)準(zhǔn)品溶液，然后按照2.3步驟進(jìn)行處理，每個(gè)濃度進(jìn)樣2次，記錄各種濃度標(biāo)準(zhǔn)品溶液中的丙戊酸鈉和內(nèi)標(biāo)物的峰面積。以丙戊酸鈉和內(nèi)標(biāo)物峰面積之比(R)為橫坐標(biāo)，以血清中丙戊酸鈉終濃度(C)為縱坐標(biāo)，計(jì)算丙戊酸鈉線性回歸方程和相關(guān)系數(shù)(r)，繪制丙戊酸鈉標(biāo)準(zhǔn)曲線，得到標(biāo)準(zhǔn)曲線為Y=87.79X-3.885(r=0.9979，n=6)如圖2，內(nèi)標(biāo)物和丙戊酸鈉保留時(shí)間分別約為6.3 min和11.8 min，最后結(jié)果顯示丙戊酸鈉血藥濃度在13.3～160.7 μg/mL范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。以信噪比(S/N)=6計(jì)算，丙戊酸鈉最低檢測(cè)限為1.0 μg/mL。

圖2丙戊酸鈉標(biāo)準(zhǔn)曲線圖

2.6精密度試驗(yàn)根據(jù)2.2.1方法配制丙戊酸鈉高、中、低(1.607mg/mL、0.803mg/mL、0.133mg/mL)3種濃度，然后按照2.5標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備方法處理，得到血清中丙戊酸鈉終濃度為160.7 μg/mL、80.3 μg/mL、13.3 μg/mL的樣品，然后進(jìn)樣檢測(cè)，計(jì)算并記錄血清中丙戊酸鈉實(shí)測(cè)濃度，每日重復(fù)測(cè)定5次，重復(fù)測(cè)定5 d，計(jì)算日內(nèi)、日間RSD值，結(jié)果見表1。

表1精密度試驗(yàn)結(jié)果(n=5)

終濃度/(μg/mL)日內(nèi)實(shí)測(cè)濃度/(μg/mL)RSD/%日間實(shí)測(cè)濃度/(μg/mL)RSD/%160.7182.8±8.44.6172.2±12.17.080.380.2±0.80.977.4±4.05.213.312.0±0.86.411.8±1.08.2

2.7回收率試驗(yàn)

2.7.1方法回收率取空白血清數(shù)份，分別加入濃度為1.607mg/mL、0.803mg/mL、0.133mg/mL的丙戊酸鈉標(biāo)準(zhǔn)品，然后按照步驟2.3進(jìn)行處理，每個(gè)濃度各做5份，根據(jù)丙戊酸鈉標(biāo)準(zhǔn)曲線和線性回歸方程計(jì)算各濃度標(biāo)準(zhǔn)品中丙戊酸鈉的實(shí)測(cè)濃度Ct，計(jì)算丙戊酸鈉實(shí)測(cè)濃度與理論濃度Cs之比，方法回收率(%)m= Ct /Cs×100%，結(jié)果見表2。

2.7.2萃取回收率取空白血清數(shù)份，分別加入濃度為1.607mg/mL、0.803mg/mL、0.133mg/mL的丙戊酸鈉標(biāo)準(zhǔn)品，然后按照步驟2.3進(jìn)行處理(不加內(nèi)標(biāo)物)，每個(gè)濃度各做5份，記錄各濃度標(biāo)準(zhǔn)品中丙戊酸鈉峰面積R0，另取濃度為以上各丙戊酸鈉標(biāo)準(zhǔn)品，加甲醇稀釋制得終濃度為160.7 μg/mL、80.3 μg/mL、13.3 μg/mL的對(duì)照溶液再按照步驟2.3進(jìn)行處理后，每個(gè)濃度各做5份，然后進(jìn)樣檢測(cè)，記錄各濃度對(duì)照品溶液中丙戊酸鈉峰面積Rs，萃取回收率(%)e=R0/Rs×100%，結(jié)果見表2。

表2回收率試驗(yàn)結(jié)果(n=5)

終濃度/(μg/mL)方法回收率m/%RSD/%萃取回收率e/%RSD/%160.7107.2±7.57.089.5±8.16.480.396.4±5.05.287.9±6.77.513.388.6±7.28.282.1±3.08.9

2.8專一性試驗(yàn)由于臨床上合用藥物有可能對(duì)丙戊酸鈉血藥濃度檢測(cè)有影響，根據(jù)本實(shí)驗(yàn)的臨床檢測(cè)和藥動(dòng)學(xué)研究，在步驟2.1色譜條件下，對(duì)可能合用的幾種藥物，如苯妥英鈉、卡馬西平、苯巴比妥、地西泮、拉莫三嗪等進(jìn)行分析，結(jié)果上述藥物在本實(shí)驗(yàn)色譜條件下不出峰，所以以上藥物對(duì)本實(shí)驗(yàn)測(cè)定無干擾，不會(huì)影響丙戊酸鈉血藥濃度的測(cè)定。

2.9穩(wěn)定性試驗(yàn)丙戊酸鈉標(biāo)準(zhǔn)品和其他相關(guān)配制溶液放置于4℃的冰箱中冷藏，分別在第1、3、5、8、11、15d時(shí)用1.067mg/mL、0.534mg/mL、0.267mg/mL丙戊酸鈉標(biāo)準(zhǔn)液和其他相關(guān)溶液進(jìn)行濃度測(cè)定。結(jié)果顯示丙戊酸鈉標(biāo)準(zhǔn)液含量未發(fā)生明顯變化，說明丙戊酸儲(chǔ)備液及相關(guān)溶液在15 d內(nèi)穩(wěn)定性良好。

3討論

本實(shí)驗(yàn)室用甲醇-水(72∶28)為流動(dòng)相，可以使主峰分離完全，峰型良好并且主峰保留時(shí)間分別為6.3 min和12.8 min較為合理，能夠滿足方法驗(yàn)證要求，同時(shí)達(dá)到節(jié)省流動(dòng)相的目的。部分文獻(xiàn)顯示色譜條件為流動(dòng)相甲醇-水(80∶20)，檢測(cè)波長(zhǎng)235 nm、265 nm，柱溫30℃時(shí)[6-7]，結(jié)果不能適用本實(shí)驗(yàn)室臨床檢測(cè)。利用DAD二極管陣列檢測(cè)器紫外全波段掃描顯示，丙戊酸鈉在衍生后在202 nm、248 nm和264 nm處有吸收，為避免與溶劑截止波長(zhǎng)和雜質(zhì)干擾，在波長(zhǎng)248 nm處主峰吸收合理，峰型好。可知，應(yīng)根據(jù)實(shí)驗(yàn)室具體條件：如色譜柱長(zhǎng)短、檢測(cè)器原理、流動(dòng)相比例和衍生試劑的不同等因素合理選擇檢測(cè)波長(zhǎng)。

由于丙戊酸鈉自身在紫外條件下無吸收，必須經(jīng)歷酸化、萃取、衍生化后才能在紫外波長(zhǎng)下有吸收，因此合理選擇酸化劑、萃取劑和衍生化催化劑直接關(guān)系檢測(cè)結(jié)果。值得一提的是本實(shí)驗(yàn)觀察到乙醚作為萃取劑時(shí)，由于其揮發(fā)性強(qiáng)、毒性大等特點(diǎn)，與正己烷作為萃取劑相比得到的峰型較小，而正己烷可以達(dá)到萃取完全、損失少、相對(duì)安全的效果。在實(shí)驗(yàn)水浴催化衍生化階段，三乙胺作為催化劑加入體積為20 μL，當(dāng)增加三乙胺加入的量為50 μL和100 μL時(shí)[8-9]，其實(shí)驗(yàn)結(jié)果并無改善，因此可選擇節(jié)約的試劑成本。有文獻(xiàn)顯示實(shí)驗(yàn)在衍生階段選擇50℃水浴10 min[10]，結(jié)果發(fā)現(xiàn)主峰峰面積較小，且與內(nèi)標(biāo)峰面積比不穩(wěn)定、波動(dòng)大，可能是水浴反應(yīng)不完全造成。最后，本實(shí)驗(yàn)選擇55℃水浴15 min后通入氮?dú)獠⒗^續(xù)水浴直至溶劑揮發(fā)干，相對(duì)于自然揮發(fā)和水浴完全后再吹干，本實(shí)驗(yàn)采用的方法溶劑揮發(fā)完全濃縮好，且用時(shí)短一般3 min左右，降低了衍生物質(zhì)接觸空氣被氧化變質(zhì)的風(fēng)險(xiǎn)，同時(shí)節(jié)省了氮?dú)赓Y源。因此本法適用于本院丙戊酸鈉血藥濃度檢測(cè)，同時(shí)實(shí)驗(yàn)結(jié)果可靠、準(zhǔn)確度高、重復(fù)性好和節(jié)約實(shí)驗(yàn)室成本，可為臨床合理用藥提供參考。

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Modified high performance liquid chromatography to determine the concentration of sodium valproate in human serum

SHEN Chenjun,CHEN Xingui,WANG Yong,HU Xiuping

Department of Clinical Pharmacy,The First People′s Hospital of Chuzhou,Chuzhou 239000,China

【Abstract】Objective：To improve the high performance liquid chromatography(HPLC)for determination of the sodium valproate concentration in human serum in order to supply evidence with rational use of this drug.Methods:Cyclohexanecarboxylic acid was used as the internal standard.The serum samples were extracted with n-hexane after acidification and precipitation by sulphuric acid,and subjected to treatment with 2-bromoacetophenone as derivative reagent and triethylamine as catalytic agent.Then the samples were determined by HPLC as protocol:chromatographic column,ZORBAX SB-C18(150 mm×4.6 mm,5 μm);mobile phase,methanol-water(72∶28)at flow rate of 1.0 mL/min;detection wavelength set at 248nm;the column temperature at 25℃,and sample size in 10 μL.Results:The linear range of sodium valproate was 13.3-160.7 μg/mL(r=0.9979,n=6).The recovery rate for the sodium valproate in low,middle and high concentration and extraction recovery rate was 88.6%-107.2% and 82.1%-89.5%,respectively.The RSD of intra-day and inter-day were less than 6.4% and 8.2%,respectively.Conclusion:The modified HPLC technique can satisfy the needs of clinically monitoring the valproate concentration in patients,for it has higher specificity and accuracy as well as better linear dependence and reduced laboratory cost.

【Keywords】high performance liquid chromatography;sodium valproate;serum concentration;pharmacokinetics

文章編號(hào)：·藥學(xué)·1002-0217(2016)01-0018-04

收稿日期：2015-07-24

作者簡(jiǎn)介：沈陳軍(1987-)，男，藥師，(電話)0550-3525729，(電子信箱)jwets@126.com.

【文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼】【中圖號(hào)】R 969.1A