用于激光捕獲顯微切割的組織冰凍切片制作方法探討

段仁杰，林愛琴，汪根蓮，李鐵臣,孫　青

(1.皖南醫(yī)學院第一附屬醫(yī)院 弋磯山醫(yī)院　婦產(chǎn)科，安徽　蕪湖　241001;2.皖南醫(yī)學院　分子生物學研究室，安徽　蕪湖　241001)

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用于激光捕獲顯微切割的組織冰凍切片制作方法探討

段仁杰1，2，林愛琴2，汪根蓮1，2，李鐵臣2,孫青1

(1.皖南醫(yī)學院第一附屬醫(yī)院 弋磯山醫(yī)院婦產(chǎn)科，安徽蕪湖241001;2.皖南醫(yī)學院分子生物學研究室，安徽蕪湖241001)

【摘要】目的：探討經(jīng)樣本保存液處理的組織用于激光捕獲顯微切割技術冰凍切片的制作技術與方法。方法：以手術中切取的子宮內(nèi)膜組織為標本。經(jīng)樣本保存液處理后，置于冰箱冷凍保存，經(jīng)切片、染色，用于激光捕獲顯微切割。結(jié)果：在傳統(tǒng)切片的基礎上，改良后的切片更適用于激光捕獲顯微切割及相關實驗。結(jié)論：改良的切片滿足了激光捕獲顯微切割技術的要求和組織學觀察的精確性。

【關鍵詞】激光捕獲顯微切割；冰凍切片；切片染色

【DOI】10.3969/j.issn.1002-0217.2016.01.005

冰凍切片被廣泛用于手術中，主要用于分辨疾病的良性和惡性病變[1-2]。隨著醫(yī)學科學技術的不斷發(fā)展，冰凍切片也被廣泛運用于科學研究中。冰凍切片的制作是激光捕獲顯微切割(laser capture microdissection，LCM)技術中的關鍵一步，切片質(zhì)量的好壞直接影響LCM對目標細胞的捕獲及后續(xù)試驗結(jié)果的準確性。一般經(jīng)樣本保存液處理過的組織標本，含水量大，增加了冰凍切片制作的難度。本文以本實驗室所使用的Leicacm 1900型冰凍切片機(德國徠卡公司)為例，對經(jīng)樣本保存液處理的組織用于LCM中冰凍切片的制作技術與方法作一介紹。

1資料與方法

1.1標本來源人子宮內(nèi)膜組織標本來自皖南醫(yī)學院附屬弋磯山醫(yī)院婦產(chǎn)科。術中無菌條件下采集組織標本后置于存有樣本保存液的無菌無RNA酶的離心管內(nèi),4℃冰箱過夜后轉(zhuǎn)入干燥離心管中，-20℃低溫冰箱保存。

1.2方法

1.2.1實驗標本的處理切片前用醫(yī)用紗布包裹組織標本，吸干組織表面水分。

1.2.2包埋從冰凍切片機的機箱中取出包埋托，用紗布擦除表面冰霜。在包埋托上鋪一層OCT包埋劑(德國徠卡產(chǎn)品)，放入機箱內(nèi)待其凝固后修平。將吸干的子宮內(nèi)膜組織標本切成0.2～0.4cm厚，切面向上平鋪在包埋托近邊緣處(圖1，傳統(tǒng)方法是將組織平鋪在包埋托中心處)，再用OCT包埋劑在包埋托上覆蓋一層并將組織完全包埋在內(nèi)。

1.2.3切片包埋托含有組織的部位在下固定在凍頭上，將組織削平至組織面最大為宜(圖1A)。切片時右手搖動轉(zhuǎn)輪控制切片速度，左手用毛刷輕按切片邊緣部分，邊切邊拉，待切片即將與包埋托分離時，停止切片(切片與包埋托分離易出現(xiàn)卷曲，不利貼片，圖1B)，將切片粘附在玻片的中央(傳統(tǒng)方法固定好包埋托后，把防卷板調(diào)試切片最佳狀態(tài)，然后切片)。重復此操作，盡量在玻片上多貼一些組織切片。

1.2.4樣本保存液處理、乙醇固定滴加樣本保存液覆蓋玻片含有組織的部位，室溫孵育4 min，0.1%DEPC水洗數(shù)秒。切片用梯度酒精固定，無水乙醇30 s，95%乙醇30 s，70%乙醇數(shù)秒，0.1%DEPC水洗數(shù)秒(傳統(tǒng)方法不經(jīng)樣本保存液處理，直接酒精甲醛固定)。

A.固定包埋托；B.切片方式。

圖1冰凍切片的制作

1.2.5染色此過程所有需配制的試劑均用高溫高壓滅菌的0.1%DEPC水配制。①將固定后的切片放入蘇木素染液染核1～2 min，0.1%DEPC水洗30 s。②伊紅染色2 s，0.1%DEPC水洗數(shù)秒。③70%、95%、100%的乙醇分別脫水10 s、30 s、30 s。④二甲苯Ⅰ、Ⅱ各透明10 s。吹風機冷風吹干后，立即進行LCM(傳統(tǒng)染色試劑的配置均用蒸餾水，切片的清洗也用蒸餾水。在蘇木素染核后還有鹽酸分化，氨水返藍兩步)。

2結(jié)果

2.1切片的比較及目標細胞的捕獲樣本保存液處理的子宮內(nèi)膜組織經(jīng)此染色過程所制冰凍切片，在ABI Arcturus XT LCM儀器(美國ABI公司)顯微鏡下觀察，染色效果雖不及傳統(tǒng)染色方法，但組織結(jié)構完整，細胞形態(tài)可分辨(圖2A、B)。按上述改良過的切片過程和染色方法，樣本保存液處理的子宮內(nèi)膜組織所制的冰凍切片，經(jīng)LCM順利捕獲到上皮目標細胞(圖3)。

A.傳統(tǒng)切片染色;B.改良后的切片染色。

圖2 改良前后子宮內(nèi)膜組織切片圖(HE×400)

A.捕獲前的切片;B.捕獲后的切片;C.帽子上捕獲的目的細胞。

圖3LCM捕獲結(jié)果(HE×100)

2.2兩種切片RNA含量的比較利用LCM技術從12例子宮內(nèi)膜組織標本所制的兩種切片上捕獲相同數(shù)量上皮細胞。相同條件下，提取細胞內(nèi)總RNA,qRT-PCR方法檢測目標基因β-actin的表達。采用SPSS18.0進行統(tǒng)計分析，傳統(tǒng)切片組的平均CT值為(21.76±3.80)HU，改良后切片組平均CT值為(18.38±3.50)HU，t=2.26，P<0.05,兩組之間差異有統(tǒng)計學意義。傳統(tǒng)切片捕獲后檢測到的CT值較改良后切片CT值大，即傳統(tǒng)切片所對應的初始模板cDNA量比較低，說明從傳統(tǒng)切片上所取細胞中RNA含量比從改良后切片上所取細胞中RNA含量低。

3討論

LCM技術是近幾年發(fā)展起來的新興技術，能在顯微鏡下觀察特異性組織和細胞，在基本不損傷細胞內(nèi)蛋白質(zhì)、DNA和RNA的條件下，從細胞群中分離出純細胞群或單一細胞，成功解決了細胞異質(zhì)性問題[5-8]。冰凍切片的制作是LCM技術中關鍵的一步，切片質(zhì)量的好壞直接影響LCM對目標細胞的捕獲及后續(xù)試驗結(jié)果的準確性。

冰凍切片中冰晶的形成，易在切片中形成空白區(qū)，細胞內(nèi)空泡增多，使組織結(jié)構不易分辨。經(jīng)樣本保存液處理的組織標本通常含水量大，易形成冰晶。切片前，用干紗布將組織表面水分吸干。這樣在很大程度上避免了因組織水分過多，冷凍后冰晶過多現(xiàn)象。LCM冰凍切片要盡量將切片含有組織的部位粘附在玻片中央，這樣有利于LCM中帽子的放置。在不能連續(xù)切片的情況下，按照常規(guī)用玻片直接去粘附切片時，要將切片含有組織的部位貼在玻片的中央，凍頭恰好阻礙了此操作過程。為此我們將組織包埋在包埋托的近邊緣處，將包埋托含有組織的部位在下固定在凍頭上，如此切出的切片含有組織的部位與凍頭的距離拉遠了，有利于將切片含有組織的部位貼在玻片的中央。

在冰凍切片中，防卷板對切片也會產(chǎn)生很大影響。每次切片都要對防卷板進行調(diào)試，如果調(diào)試不當，很難切出平整的切片。本實驗在制作切片時，放棄使用防卷板，采用邊切邊用毛刷輕輕按住切片邊緣向后拉的方式切片。省去了每次切片都要對防卷板的調(diào)試過程，縮短了切片時間。

LCM冰凍切片所有染色試劑的配制均用高溫高壓滅菌的DEPC水配制，保證切片在染色過程中不被DNA酶、RNA酶污染。同時在不影響切片觀察和細胞篩選的情況下，省去了傳統(tǒng)切片染色中分化和返藍兩步，縮短了染色時間。本實驗通過對傳統(tǒng)切片制作過程與染色上的改進，不僅成功制作出了經(jīng)樣本保存液處理的子宮內(nèi)膜組織標本的冰凍切片，同時簡化了切片和染色過程，縮短了制片時間，制作出更符合LCM要求的冰凍切片。

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Preparation of frozen tissue sections for laser capture microdissection

DUAN Renjie,LIN Aiqin,WANG Genlian,LI Tiechen,SUN Qing

Department of Obstetrics and Gynecology,The First Affiliated Hospital,Wannan Medical College,Wuhu 241001,China

【Abstract】Objective：To investigate the technology and approaches to producing a frozen section for laser capture microdissection.Methods:Surgically resected endometrial tissue was obtained.Then the specimens were treated with preservation solution and frozen in an icebox,and subjected to section and staining for laser capture microdissection.Results:On conventional section preparation basis,the modified profile led to excellent quality of tissue sections for laser capture microdissection or use in related experiment.Conclusion:Our improved technology can result in quality sections to satisfy the laser capture microdissection and accurate histological observation.

【Keywords】laser capture microdissection;frozen section;Slice dyeing

文章編號：·基礎醫(yī)學·1002-0217(2016)01-0016-03

基金項目：安徽省高校省級自然科學研究重點項目(KJ2014A267)

收稿日期：2015-07-30

作者簡介：段仁杰(1987-)，男，2013級碩士研究生，(電話)18375348008，(電子信箱)545005120@qq.com;

【文獻標識碼】【中圖號】R 318.51A

孫青，女，副主任醫(yī)師，副教授，碩士生導師，(電子信箱)sunqingl@126.com,通訊作者.