AAVC-Ⅰ對人口腔鱗癌Tca8113細胞GRP78和Caspase-4基因表達的影響

任琳琳，柴　琳

(皖南醫學院　1.病理生理學教研室；2.口腔醫學院，安徽　蕪湖　241002)

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AAVC-Ⅰ對人口腔鱗癌Tca8113細胞GRP78和Caspase-4基因表達的影響

任琳琳1，柴琳2

(皖南醫學院1.病理生理學教研室；2.口腔醫學院，安徽蕪湖241002)

【摘要】目的：研究不同濃度的AAVC-Ⅰ對人口腔鱗癌Tca8113細胞GRP78、Caspase-4基因表達的影響。方法:設置正常對照組和AAVC-Ⅰ實驗組，Trizol試劑提取各組總RNA，運用RT-PCR法擴增內參基因β-actin及目的基因GRP78、Caspase-4片段，ChemiDoc XRS凝膠成像系統觀察電泳結果并采用 QuantityOne軟件測定目的條帶灰度值。結果：正常對照組、實驗組均擴增出GRP78、Caspase-4目的條帶，且隨AAVC-Ⅰ濃度增大GRP78、Caspase-4表達增加。結論：高濃度AAVC-Ⅰ可上調GRP78、Caspase-4基因的表達，因此AAVC-Ⅰ可能誘導人口腔鱗癌Tca8113細胞發生了內質網應激。

【關鍵詞】AAVC-Ⅰ;GRP78；Caspase-4；Tca8113；內質網應激

【DOI】10.3969/j.issn.1002-0217.2016.01.004

蛇毒是一種復雜的蛋白質混合物，含有多種毒素和酶類，具有很大的潛在藥用價值，已有大量研究證實，蛇毒提取成分在凝血、抗血栓、止痛及抗腫瘤等方面發揮重要作用,其中抗腫瘤作用已成為廣大學者研究的焦點。尖吻蝮蛇毒抑瘤組分 1(anti-tumor component-Ⅰ from Agkistrodon acutus venom，AAVC-Ⅰ)是本校蛇毒研究所利用蛋白分離純化技術從皖南尖吻蝮蛇毒中提取的一種活性成分，且已證實其具有很好的抗凝血作用[2-3]，而有關其抗腫瘤的作用國內外報道較少。實驗室前期研究表明AAVC-Ⅰ對小鼠肺癌LLC細胞、A549和K562具有增殖抑制和誘導凋亡的作用[4-6]。本實驗以Tca8113細胞為研究對象，進一步探討AAVC-Ⅰ的抗腫瘤作用，為開發高效抗腫瘤藥物更好服務臨床提供理論依據。

1資料與方法

1.1主要試劑與儀器AAVC-Ⅰ凍干粉由本校蛇毒研究所提供。PBS緩沖液、RPMI1640液體培養基(賽默飛世爾生物化學制品有限公司),無支原體胎牛血清(杭州四季青公司)，青霉素-鏈霉素溶液、胰酶消化液(碧云天生物技術公司)，GRP78、Caspase-4、CHOP引物合成(南京金斯瑞生物科技有限公司)，RNA提取試劑Trizol(美國Invitrogen公司)，逆轉錄試劑盒(Thermo公司)，擴增試劑盒(Thermo公司)。細胞培養箱(Thermo)，倒置相差顯微鏡(日本OLYMPUS IX51)，超凈工作臺(上海三發科學儀器有限公司)，DYY-10C電泳儀、水平電泳槽(北京六一儀器廠)，ChemiDoc XRS凝膠成像系統(美國BIO-RAD公司)，S1000 ThermalCyclerPCR儀(美國BIO-RAD公司)，NANO DROP2000分光光度計(Thermo公司)，SCILOGEX D1008掌上離心機(美國SCILOGEX 公司)。

1.2細胞培養人口腔鱗癌細胞Tca8113來自課題組凍存保留，培養液配制：RPMI1640液體培養基加10%胎牛血清加1%青霉素-鏈霉素溶液，將Tca8113接種于培養瓶中，37℃、5%CO2飽和濕度的培養箱中常規培養，待細胞長至80%左右，胰蛋白酶消化后進行分瓶傳代。

1.3倒置顯微鏡觀察不同濃度AAVC-Ⅰ干預后細胞形態的變化。

1.4RT-PCR檢測GRP78、Caspase-4基因片段表達Trizlo試劑提取總RNA，NANO DROP2000分光光度計測定RNA濃度。12 μL反轉錄體系：TemplateRNA 5 μL，Oligo(dt)181 μL，H2O(nuclease-free)6 μL，離心混勻，70℃、5 min，取出迅速置于冰盒內，3 min后加入5×Reaction Buffer 4 μL、RiboLock RNase inhibitor(20U/μL)1 μL、10 mmol/L dNTPMix 2 μL、RevertAid MuLVRT(200U/μL)1 μL，離心混勻，42℃60 min，95℃5 min以滅活反轉錄酶。β-actin、GRP78、Caspase-4引物由南京金斯瑞生物科技有限公司合成，序列、擴增產物長度、退火溫度見表1。

表1引物序列、產物長度及退火溫度

基因引物序列產物堿基數/bpTm/℃β-actinF:5'-AGCGAGCATC-CCCCAAAGTT-3'28558R:5'-GGGCACGAAGGCTCAT-CATT-3'GRP78F:5'-CTATGTCGCCTTCACTCC-3'13250R:5'-ACAGACGGGTCATTCCAC-3'Caspase-4F:5'-TCACAGGGATGAAGGAGC-3'44951R:5'-TGGCGTTGAAGAGCAGAA-3'

50 μL PCR反應體系：PCR Master Mix(2×)25 μL、Forward primer 5 μL(1 μmol/L)、Reverse primer 5 μL(1 μmol/L)、Template DNA 1 μL(1 μg/μL)、H2O(nuclease-free)14 μL。

2結果

2.1AAVC-Ⅰ作用后Tca8113細胞形態變化正常Tca8113細胞呈不規則的多邊形或梭形，胞質均勻，細胞間分界明顯，貼壁生長。AAVC-Ⅰ作用12 h后隨濃度增加(0、3.125、6.25、12.5 μg/mL)，Tca8113細胞體積變小，細胞間隙增大，半貼壁細胞或懸浮細胞增加，出現凋亡細胞樣改變,細胞皺縮變圓，胞質密度增加，細胞膜破壞，細胞融合抱團界限不清(如圖1所示)。

A：正常對照組(×200)；B:AAVC-Ⅰ 3.125 μg/mL組(×200)；C:AAVC-Ⅰ 6.25 μg/mL組(×200)；D:AAVC-Ⅰ 12.5 μg/mL組(×200)。

圖1不同濃度AAVC-Ⅰ作用下細胞形態改變

2.2瓊脂糖凝膠電泳配制2%瓊脂糖凝膠，β-actin、GRP78、Caspase-4 PCR擴增產物上樣，每孔5 μL樣品+BeyoRed DNA上樣緩沖液(6×)1 μL，選擇110 V，50 min進行電泳，運用ChemiDoc XRS凝膠成像系統(美國BIO-RAD公司)拍照，正常對照組、實驗組均擴增出β-actin、GRP78、Caspase-4目的條帶，其中β-actin穩定表達，GRP78、Caspase-4隨AAVC-Ⅰ(0、3.125、6.25、12.5 μg/mL)濃度增大表達增加。如圖2、3示。

2.3數據分析采用 QuantityOne軟件分別檢測正常對照組和AAVC-Ⅰ實驗組目的條帶灰度值，各組GRP78與內參基因的比值如表2示，Caspase-4與內參基因的比值如表3示，AAVC-Ⅰ實驗組隨濃度的增大，GRP78、Caspase-4基因表達水平較正常組顯著上調，P<0.05代表其差異具有統計學意義。

M:DNA Ladder；1,2,3,4泳道各AAVC-Ⅰ(0、3.125、6.25、12.5 μg/mL)實驗組β-actin及GRP78、Caspase-4目的條帶。

圖2不同濃度 AAVC-Ⅰ作用下GRP78基因表達

M:DNA Ladder；1,2,3,4泳道各AAVC-Ⅰ(0、3.125、6.25、12.5 μg/mL)實驗組β-actin及GRP78、Caspase-4目的條帶。

圖3不同濃度 AAVC-Ⅰ作用下Caspase-4基因表達

組別AAVC-Ⅰ/(μg/mL)GRP78/β-actin對照組00.3598±0.02655實驗組3.1250.6127±0.066506.250.8228±0.0515612.50.8969±0.07941F值49.486P值<0.01

組別AAVC-Ⅰ/(μg/mL)Caspase-4/β-actin對照組00.0545±0.00134實驗組3.1250.2493±0.006206.250.7081±0.0148012.50.8058±0.01891F值2527.950P值<0.01

3討論

口腔鱗癌作為頭頸部常見的腫瘤性疾病之一,目前主要采用手術為主的綜合治療[7-8]，預后較差，且嚴重影響人們的面容，給患者帶來身心上的傷害，亟待尋求一種有效的治療藥物。文獻報道蛇毒提取物不但具有止痛、抗凝等作用，還可通過誘導腫瘤細胞凋亡，起到抗腫瘤作用。李鳳君等[10]研究表明眼鏡蛇心臟毒素(CTX)對肺癌A549細胞具有增殖抑制作用，可促進線粒體內細胞色素C的釋放，降低線粒體膜電位,激活Procaspase-9和 Procaspase-3通過線粒體途徑誘導 A549細胞凋亡。同時有研究AAVC-Ⅰ顯示從尖吻蝮蛇毒中提取的細胞毒素ACTX-6，能激活Fas通路使JNK表達上調，進而級聯激活caspase-3，誘導A549細胞凋亡[11]。因此，研究蛇毒抗腫瘤機制，開發新的抗腫瘤藥物成為必然趨勢。

本實驗利用RT-PCR法檢測AAVC-Ⅰ作用后Tca8113細胞GRP78、Caspase-4基因表達情況，發現隨AAVC-Ⅰ濃度增大，GRP78、Caspase-4基因表達呈上升趨勢，提示AAVC-Ⅰ可能誘導人口腔鱗癌Tca8113細胞發生了內質網應激反應。死亡受體途徑和線粒體途徑是誘導細胞凋亡的主要途徑，也是研究較多的途徑，近些年來發現內質網應激作為一條新的途徑也可誘導腫瘤細胞凋亡。缺氧、毒物、理化因素等誘發內質網應激的產生，Caspase-4、GRP78是內質網應激的標志分子，其中GRP78位于內質網膜上，負責蛋白質的折疊及轉運，正常情況下與內質網應激啟動蛋白PERK、AIF6、IRE1結合，在內質網應激發生時GRP78與三者分離表達增加，并結合內質網內錯誤折疊及未折疊蛋白將其轉運出去[12-13]，而游離之后的PERK、AIF6、IRE1轉變為活性分子，可啟動下游細胞凋亡相關信號分子如：TRAF2、JNK、ASKT等來誘導細胞凋亡。Caspase-4在內質網應激時被活化的IRE1激活，進而級聯激活下游caspase家族信號分子，誘導凋亡反應。

本實驗將不同濃度的AAVC-Ⅰ處理Tca8113細胞，發現Caspase-4、GRP78隨著AAVC-Ⅰ濃度增大其表達逐漸增加，其中3.125 μg/mL、6.25 μg/mL兩組差值較6.25 μg/mL、12.5 μg/mL兩組差值大，考慮AAVC-Ⅰ誘發內質網應激具有一定的濃度范圍，CHOP通路、JNK-ASKT、Caspase-4/Caspase-12通路是內質網應激誘發凋亡的主要通路，AAVC-Ⅰ具體通過哪一條通路誘導Tca8113細胞凋亡還需進一步研究。

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Effects of AAVC-Ⅰ on GRP78 and Caspase-4 gene expression in human oral squamous cell carcinoma Tca8113

REN Linlin，CHAI Lin

Department of Pathophysiology,Wannan Medical College,Wuhu 241002,China

【Abstract】Objective：To observe the effects anti-tumor component-Ⅰ from Agkistrodon acutus venom(AAVC-Ⅰ)in diverse dosage on the expression GRP78 and Caspase-4 gene in human oral squamous carcinoma Tca8113 cell lines.Methods:The experiment was performed in normal control group and AAVC-Ⅰ group.Trizol reagent was used to extract total RNA in each group,and RT-PCR was performed to amplify the internal control β-actin gene and fragments of GRP78 and Caspase-4.ChemiDoc XRS gel imaging system was used to observe electrophoresis presentation,and QuantityOne software to measure the gray value in the target band.Results:Both GRP78 and Caspase-4 were amplified,and the expression of these two genes was up-regulated with increased dose of AAVC-Ⅰ.Conclusion:High dose of AAVC-Ⅰ can increase the expression of GRP78 and Caspase-4 genes,suggesting that AAVC-Ⅰ may induce endoplasmic reticulum stress in the oral squamous carcinoma Tca8113 cell lines.

【Keywords】AAVC-Ⅰ;GRP78;Caspase-4;Tca8113;endoplasmic reticulum stress

文章編號：·基礎醫學·1002-0217(2016)01-0012-04

基金項目：皖南醫學院重點科研培育基金項目(WK2015Z08)

收稿日期：2015-08-11

作者簡介：任琳琳( 1985-),女,2013級碩士研究生，(電話)18375348220,(電子信箱)747104463 @qq.com；

【文獻標識碼】【中圖號】R 739.8A

柴琳,女,副教授,碩士生導師,(電子信箱)869319562@qq.com，通訊作者.