格列齊特對(duì)2型糖尿病大鼠腎臟組織中HIF-1α和VEGF表達(dá)的影響

操　軒，胡亞琳

(黃石市中心醫(yī)院　腎內(nèi)科，湖北　黃石　435000)

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格列齊特對(duì)2型糖尿病大鼠腎臟組織中HIF-1α和VEGF表達(dá)的影響

操軒，胡亞琳

(黃石市中心醫(yī)院腎內(nèi)科，湖北黃石435000)

【摘要】目的：探討分析格列齊特對(duì)2型糖尿病大鼠腎功能、腎臟病理學(xué)、缺氧誘導(dǎo)因子-1α(hypoxia Inducible factor-1α，HIF-1α)及血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)影響。方法：48只雄性SD大鼠，隨機(jī)分為空白組(control group，CG)，模型組(model group，MG)以及格列齊特組(gliclazide group，GG)，每組16只，MG組和GG組高脂飲食6個(gè)月誘導(dǎo)2型糖尿病大鼠模型，造模成功后GG組給予格列齊特24mg/(kg·d)灌胃治療，其他二組予生理鹽水參照；治療6周和12周后，每組均處死大鼠各半，收集血清及腎臟行相關(guān)檢測(cè)。結(jié)果：CG腎組織切片層次分明，無(wú)炎癥反應(yīng)，MG組有明顯的炎癥反應(yīng)，治療6周后明顯改善，治療12周后進(jìn)一步改善；治療6周后血清腎功能指標(biāo)血尿素氮、血肌酐和血尿素GG組明顯低于MG組(P<0.05)，治療12周后進(jìn)一步降低；腎組織HIF-1α及VEGF蛋白和mRNA表達(dá)，治療6周后GG組明顯低于MG組(P<0.05)，治療12周后進(jìn)一步降低。結(jié)論：格列齊特可抑制HIF-1α及VEGF的表達(dá)，改善2型糖尿病大鼠腎功能。

【關(guān)鍵詞】格列齊特； 缺氧誘導(dǎo)因子-1α； 血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子； 2型糖尿病； 大鼠

【DOI】10.3969/j.issn.1002-0217.2016.01.003

糖尿病與腫瘤、心血管疾病并稱為威脅人類(lèi)健康的三大慢性非傳染性疾病。本病危害不僅是血糖升高，由血糖升高帶來(lái)的心腦血管、腎病等也嚴(yán)重危害人們的健康，有研究顯示在所有血透治療患者中糖尿病腎病處于第二位，因此糖尿病腎病已經(jīng)成為威脅糖尿病患者健康的一大疾病。目前認(rèn)為血脂失調(diào)、血壓異常、氧化應(yīng)激以及血糖毒害等參與了腎病的進(jìn)展，而上述學(xué)說(shuō)均與腎缺氧密不可分。腎臟缺氧可誘導(dǎo)腎臟組織中缺氧誘導(dǎo)因子-1α(HIF-1α)表達(dá)升高，HIF-1α表達(dá)升高又可激活血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(VEGF)表達(dá)，最終造成腎臟病理反應(yīng)。本研究以高糖高脂喂養(yǎng)誘導(dǎo)2型糖尿病大鼠，分析格列齊特治療后，其腎臟組織中HIF-1α和VEGF表達(dá)特點(diǎn)，為格列齊特的藥物開(kāi)發(fā)和本病的治療提供一定的參考。

1材料與方法

1．1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及分組清潔級(jí)雄性SD大鼠48只[合格證號(hào):SCXK(鄂)2010-0004]，體質(zhì)量180～200 g，隨機(jī)分為空白組(CG)，模型組(MG)以及格列齊特組(GG)，每組16只(為保證實(shí)驗(yàn)順利進(jìn)行，研究設(shè)計(jì)時(shí)，MG組和GG組各增加了6只大鼠，期間MG組死亡4只，GG組死亡5只)。

1．2試劑盒及相關(guān)材料血尿素氮、血肌酐和血尿素試劑盒購(gòu)于南京建成生物工程研究所；瓊脂糖購(gòu)自上海仁凱生物科技有限公司；引物為生工生物(上海)股份有限公司購(gòu)買(mǎi)，總RNA提取試劑盒購(gòu)自北京博凌科為生物公司，多克隆抗體HIF-1α、單克隆抗體β-actin以及ECL發(fā)光試劑盒購(gòu)自美國(guó)Santa Cruz公司，單克隆抗體VEGF購(gòu)于Abcam公司；二抗購(gòu)于金斯瑞生物科技有限公司；ChemiDox XRS凝膠成像儀購(gòu)于BIO-RAD公司；溴化乙錠購(gòu)于上海聯(lián)碩生物科技有限公司。

1．3方法

1．3．12型糖尿病模型的建立及給藥方法造模時(shí)間為6個(gè)月(每只大鼠連續(xù)3天大鼠空腹血糖高于11.1 mol/L時(shí)確認(rèn)大鼠造模成功)，造模成功后GG給予格列齊特24mg/(kg·d)灌胃治療，CG和MG組予生理鹽水參照，治療6周和12周后，每組處死大鼠各半，收集血清以及腎臟檢測(cè)。

1．3．2標(biāo)本采集大鼠麻醉用水合氯醛腹腔注射，大鼠麻醉后綁定，碘酒消毒后，沿腹中線切開(kāi)暴露腹腔，迅速掏出腎臟，腎臟取出后置于-86 ℃超低溫冰箱保存；之后用注射器心臟迅速取血，血液提取后用3000 r/s低溫離心機(jī)離心，之后取血清，并置于-86 ℃超低溫冰箱保存。

1．4HE染色肝臟取出后，統(tǒng)一切肝左葉四分之一置于4%的中性多聚甲醛溶液中保存，之后交由我院病理科完成，得到切片后，光鏡觀察照相。

1．5半定量PCR取出腎臟小心稱取30mg用碾磨棒碾磨勻漿，勻漿后用組織總RNA提取試劑盒提取總RNA(總RNA提取后行凝膠電泳，見(jiàn)圖1，從圖1可以看出，總RNA提取較好)，總RNA提取后，取1uL行定量并調(diào)平，之后參照文獻(xiàn)進(jìn)行PCR擴(kuò)增mRNA和電泳，電泳完成后凝膠成像儀采集圖像，Image J計(jì)算灰度值，采用β-actin，每組實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，引物序列如下，HIF-1α引物設(shè)計(jì)為：Primer A：5′-AATGGGATCGTGAAACGCCG-3′，Primer B ：5′-AGGGGAGCATGTTCCTGATG-3′。VEGF引物設(shè)計(jì)為Primer A：5′-AGTCACCATGGGAAGAGACT-3′，Primer B：5′-CTGTTCCGTCGACCACCATT-3′。β-actin引物設(shè)計(jì)為Primer A：5′-GTGACGGAGCGCCAAGCAAGAG-3′，Primer B：5′-ACGCACTGTAACTTGGGAAGTGTGG-3′。

圖1mRNA提取后電泳圖

1.6Western Blot檢測(cè)稱取腎臟100mg用電子勻漿機(jī)磨碎，低溫高速勻漿機(jī)離心，速度為4000 r/min，離心后取上清液分裝于1 mL的離心管中并置于超低溫冰箱中保存，使用時(shí)每組各取樣本80 μg進(jìn)行SDS-PAGE蛋白電泳，電泳按照文獻(xiàn)進(jìn)行，收集到電泳圖片后用Image J計(jì)算各條帶的灰度值，本次內(nèi)參采用β-actin，每組試驗(yàn)重復(fù)至少3次。

2結(jié)果

2．1實(shí)驗(yàn)大鼠一般情況CG組大鼠毛發(fā)整齊，精神活躍，飲食、飲水以及相應(yīng)的日常活動(dòng)均正常；造模成功后MG組和GG組大鼠造模毛發(fā)明顯雜亂，同時(shí)出現(xiàn)多尿、多飲、多食等典型糖尿病癥狀。

2．2各組大鼠血糖、胰島素和胰島素抵抗指數(shù)變化特點(diǎn)CG組大鼠FBG和HOMA-IR均較低，F(xiàn)INS較高，MG組和GG相較于CG組，F(xiàn)BG和HOMA-IR明顯升高，F(xiàn)INS明顯降低，提示大鼠已經(jīng)形成了明顯的高血糖和低胰島素血癥，2型糖尿病大鼠基本造模成功，詳見(jiàn)表1。

表1各組大鼠FBG、FINS及LnHOMA-IR表達(dá)變化

組別FBG/(mmol/L)FINS/(mIU/L)Ln/HOMA-IRCG5.44±0.3620.17±2.161.61±0.04MG16.34±2.88*16.21±2.11*2.54±0.07*GG16.71±1.87*16.44±2.62*2.52±0.11*F值10.8731.8917.39P值<0.01<0.01<0.01

注：與CG相比*P<0.05。

2．3HE染色CG組大鼠腎臟結(jié)構(gòu)清晰，腎小球以及腎小管形狀也較為致密和規(guī)則，MG組大鼠腎小管較大，腎小球受到了一定的擠壓，為輕微的炎癥反應(yīng)，治療6周后，大鼠腎小管逐步縮小，細(xì)胞趨于致密，治療12周后，大鼠腎臟結(jié)構(gòu)清晰,腎小球、腎小管形狀較為規(guī)則，但仍有一定的炎癥反應(yīng)，詳見(jiàn)圖2。

圖2大鼠腎臟切片HE染色

2.4腎功能檢測(cè)結(jié)果治療6周后，GG組與MG組相比，血尿素氮、血肌酐以及血尿酸含量明顯降低(P<0.05)，治療12周后進(jìn)一步降低，詳見(jiàn)表2。

表2治療6周、12周后大鼠腎功能比較

組別血尿素氮/(mmol/L)血肌酐/(μmol/L)血尿酸/(μmol/L)6周12周6周12周6周12周CG8.87±1.968.92±2.0711.71±3.1611.68±2.57112.55±23.11114.15±24.36MG13.14±4.2113.20±4.0517.46±2.9617.29±2.05165.26±36.52167.39±31.62GG11.12±3.21*9.54±2.89*14.72±3.75*12.32±3.15*136.01±26.46*116.50±24.11*F值27.0013.3210.8716.1617.3931.19P值<0.01<0.01<0.01<0.01<0.01<0.01

注：與MG相比，*P<0.05。

2.5大鼠HIF-1α、VEGF mRNA和蛋白表達(dá)與MG組相比，治療6周后GG組大鼠肝臟HIF-1α、VEGF mRNA和蛋白表達(dá)均明顯降低(P<0.05)，治療12周后進(jìn)一步降低(詳見(jiàn)圖3、4)。

與MG組相比，*P<0.05。

圖3腎臟組織中HIF-1α mRNA和蛋白的表達(dá)

與MG組相比，*P<0.05。

圖4腎臟組織中VEGF mRNA和蛋白的表達(dá)

3討論

2型糖尿病是以胰島素抵抗及胰島功能受損為主要特點(diǎn)的一種病癥。胰島功能受損可引起胰島素分泌不足，最終造成血糖和血脂代謝異常，血脂和血糖代謝長(zhǎng)期異常，又可造成患者發(fā)生器質(zhì)性病變，其中腎臟為人體最重要的排泄器官，2型糖尿病的發(fā)生會(huì)導(dǎo)致其發(fā)生缺氧，進(jìn)而導(dǎo)致腎功能受損及結(jié)構(gòu)異常，同時(shí)由于2型糖尿病本身除糖脂代謝異常外，還可造成炎癥反應(yīng)和氧化應(yīng)激，這些均可造成患者發(fā)生腎臟損害。由于本病比單純腎臟病更加棘手，因此有學(xué)者建議對(duì)本病應(yīng)注重防治，延緩其進(jìn)展，對(duì)保護(hù)2型糖尿病患者腎臟具有十分重要的意義。

當(dāng)前2型糖尿病患者腎臟組織缺氧已經(jīng)得到研究證實(shí)，腎臟缺氧最直接的危害是造成HIF-1α表達(dá)異常增高，HIF-1α幾乎參與了哺乳動(dòng)物所有器官的缺氧應(yīng)答[9-10]。HIF-1α本身屬于應(yīng)激蛋白，其主要介導(dǎo)機(jī)體對(duì)應(yīng)缺氧狀態(tài)，同時(shí)其也可以引起缺血/缺氧誘導(dǎo)下游基因的調(diào)控，促使下游基因分泌，造成相關(guān)基因表達(dá)[11]，腎臟細(xì)胞糖酵解反應(yīng)即為其中之一，當(dāng)腎臟組織發(fā)生缺血/缺氧表現(xiàn)時(shí)，HIF-1α自身會(huì)大量分泌，加強(qiáng)細(xì)胞糖酵解反應(yīng)，以彌補(bǔ)缺氧引起的細(xì)胞供能不足[12]；此外HIF-1α分泌的增加可刺激VEGF分泌，誘導(dǎo)新生血管形成，而高分泌的VEGF又可增加血管通透性，進(jìn)而改變腎小球?yàn)V過(guò)膜通透性，導(dǎo)致患者發(fā)生蛋白尿等典型腎臟損害表現(xiàn)[13-15]。

本次實(shí)驗(yàn)采用高脂飲食建立2型糖尿病大鼠模型，觀察格列齊特對(duì)腎臟組織中HIF-1α及VEGF蛋白表達(dá)的影響，研究結(jié)果顯示格列齊特治療后大鼠腎組織病理形態(tài)學(xué)明顯改善，但仍然有一定炎癥反應(yīng)，這提示格列齊特雖然不能治療2型糖尿病腎病，但可以延緩其進(jìn)展；此外治療后血尿素氮、血肌酐和血尿素GG組明顯低于MG組(P<0.05)，提示格列齊特可改善2型糖尿病大鼠腎功能；治療后大鼠腎組織HIF-1α及VEGF蛋白和mRNA表達(dá)GG組明顯低于MG組(P<0.05)，提示格列奇特可以調(diào)節(jié)HIF-1α及VEGF蛋白和mRNA表達(dá)，有利于延緩血糖和血脂異常造成的大鼠腎臟損害。

綜上所述，格列齊特可抑制HIF-1α及ET-1表達(dá)，改善2型糖尿病大鼠腎功能，但其是直接作用于HIF-1α及ET-1表達(dá)還是通過(guò)降低血糖改善表達(dá)的，仍有待于今后進(jìn)一步研究。

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Effects of gliclazide on the HIF-1α and VEGF expression in kidney tissue of type 2 diabetic rats

CAO Xuan,HU Yalin

Department of Kidney,Huangshi Central Hospital,Huangshi 435000,China

【Abstract】Objective：To investigate the effects of gliclazide on the kidney function,pathology and hypoxia inducible factor-1α(HIF-1α)and vascular endothelial growth factor(VEGF)expression in type 2 diabetic rats induced by high fat diet.Methods:Forty-eight male SD rats were randomly divided into control group(CG),model group(MG)and gliclazide group(GG)(n=16 for each),Rats inmg and GG groups were given high fat diet for six months to induce type 2 diabetic models.The eligible animals in GG group were intragastrically administered with gliclazide in dose of 24mg/(kg·d),and the other two with saline as placebo.By the 6th week and 12th week after treatment,half of rats in each group were sacrificed to obtain the serum and kidney tissues for examination.Results:Renal tissue sections in the CG group remained distinct with no inflammatory reaction.Although the renal tissues inmg group demonstrated significant inflammation,yet it was managed and improved after 6 and 12 weeks of treatment,respectively.The index suggestive of renal function,including blood urea nitrogen,serum creatinine and blood urea was significantly reduced in GG group by the 6th week,further decrease occurred by the 12th week(P<0.05).Expression of HIF-1α,VEGF protein and mRNA in the renal tissues was significantly lower in GG group thanmg group after six week of treatment,and the expression was further down-regulated by the 12th week(P<0.05).Conclusion:Gliclazide may inhibit the expression of HIF-1α and VEGF and improve kidney function of type 2 diabetic rats induced by high fat diet.

【Keywords】gliclazide;HIF-1α；VEGF;type 2 diabetes;rats

文章編號(hào)：·基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)·1002-0217(2016)01-0008-04

基金項(xiàng)目：湖北省自然科學(xué)研究基金項(xiàng)目(2013CFC058)

收稿日期：2015-07-07

作者簡(jiǎn)介：操軒(1972-)，男，副主任醫(yī)師，碩士，(電話)13971751872，(電子信箱)cxhyl4678@163.com;

【文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼】【中圖號(hào)】R 587.1;R 965A

胡亞琳，女，主任護(hù)師，(電子信箱)yalinhu123@126.com，通訊作者.