nm23-H1和p53基因在子宮內(nèi)膜異位癥患者異位組織中的表達及意義

汪根蓮，林愛琴，段仁杰，李鐵臣,孫　青

(1.皖南醫(yī)學院第一附屬醫(yī)院 弋磯山醫(yī)院　婦產(chǎn)科，安徽　蕪湖　241001;2.皖南醫(yī)學院　分子生物學研究室，安徽　蕪湖 241002)

?

nm23-H1和p53基因在子宮內(nèi)膜異位癥患者異位組織中的表達及意義

汪根蓮1，2，林愛琴2，段仁杰2，李鐵臣2,孫青1

(1.皖南醫(yī)學院第一附屬醫(yī)院 弋磯山醫(yī)院婦產(chǎn)科，安徽蕪湖241001;2.皖南醫(yī)學院分子生物學研究室，安徽蕪湖 241002)

【摘要】目的：通過對子宮內(nèi)膜異位癥患者的異位內(nèi)膜組織和正常對照組子宮內(nèi)膜組織中nm23-H1基因和p53基因mRNA表達水平的研究，探討nm23-H1基因和p53基因在子宮內(nèi)膜異位癥發(fā)生中的作用以及兩基因表達的相關性。方法：收集30例子宮內(nèi)膜異位癥患者的異位內(nèi)膜組織和30例正常對照組子宮內(nèi)膜組織標本，用qRT-PCR方法檢測nm23-H1基因和p53基因在兩組中的表達，并分析兩基因表達的相關性。結果：①相比于正常子宮內(nèi)膜組織，nm23-H1基因和p53基因在異位內(nèi)膜組織中的表達均下調(diào)，其表達差異具有統(tǒng)計學意義(t=2.575，P=0.015 vs t=2.708，P=0.011)。 ②nm23-H1基因和p53基因在子宮內(nèi)膜異位癥患者異位內(nèi)膜組織中的表達有一定相關性(r=0.42，P=0.02)。結論：nm23-H1基因和p53基因mRNA表達水平的下降可能與子宮內(nèi)膜異位癥的發(fā)生、發(fā)展相關。nm23-H1基因可能通過p53途徑導致子宮內(nèi)膜異位癥的發(fā)生，其確切機制仍有待進一步研究。

【關鍵詞】子宮內(nèi)膜異位癥；nm23-H1；p53；real-time qPCR

【DOI】10.3969/j.issn.1002-0217.2016.01.002

子宮內(nèi)膜異位癥是常見的婦科疾病[1～2]，育齡婦女中的發(fā)病率約為10%[1-2]，患者主要表現(xiàn)為慢性盆腔疼痛、痛經(jīng)等癥狀[1-3]，其中近一半的患者合并不孕癥[2-3]。該病雖然是一種良性疾病，卻具有惡性腫瘤浸潤和轉(zhuǎn)移的特點[3-4]，因而可能具有與癌癥相類似的發(fā)病機制，某些抑癌基因和腫瘤轉(zhuǎn)移抑制基因可能參與該病的發(fā)生與發(fā)展。nm23-H1基因是一個重要的腫瘤轉(zhuǎn)移抑制基因，與多種腫瘤的轉(zhuǎn)移潛能負相關；p53基因是迄今發(fā)現(xiàn)與腫瘤發(fā)生最相關的基因，人類50%的癌癥出現(xiàn)該基因的突變和表達異常。

本研究采集子宮內(nèi)膜異位癥患者的異位內(nèi)膜組織和正常對照組織標本各30例，運用qRT-PCR方法檢測兩組間nm23-H1基因和p53基因的表達，比較兩基因在子宮內(nèi)膜異位癥組和正常對照組中的表達差異及分析兩基因表達之間的關聯(lián)性，探討抑癌基因和腫瘤轉(zhuǎn)移抑制基因在內(nèi)異癥發(fā)生中的作用及其機制。

1資料與方法

1.1臨床資料30例子宮內(nèi)膜異位癥組織標本來自2014年9月～2015年3月皖南醫(yī)學院附屬弋磯山醫(yī)院婦產(chǎn)科經(jīng)開腹或腹腔鏡手術切除標本，均為卵巢巧克力囊腫，患者無特殊疾病史，術前3個月內(nèi)未采用過激素治療，年齡24～49歲，平均年齡(34±4.6)歲。30例對照組標本為同期婦產(chǎn)科門診行診斷性刮宮的育齡婦女的正常子宮內(nèi)膜，均為增生期子宮內(nèi)膜，患者年齡25～50歲，平均年齡(42±3.5)歲。

以上所有標本均經(jīng)鏡下病理檢查證實。術中無菌條件下采集組織標本后置于存有樣本保存液的無菌無RNA酶的離心管內(nèi),4℃冰箱過夜后轉(zhuǎn)入干燥離心管中，-20℃低溫冰箱保存，用于后續(xù)實驗。

1.2實驗方法

1.2.1總RNA的提取采用TRIzol(Invitrogen，美國 )一步法常規(guī)提取組織總RNA。紫外分光光度計檢測總RNA濃度與純度，將RNA的終濃度調(diào)至1 μg/μL。隨后逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA，反應總容量30 μL，先配制混合液A(容量14 μL)：3 μL Oligo dT(15)(Promega公司)、2 μL RNA、9 μL ddH2O,混勻、離心，70℃反應5 min，迅速置于冰上3 min，然后加入混合液B(容量16 μL):5×RT buffer 6 μL、M-MLV 1 μL、dNTPs 1.5 μL(均為Promega公司產(chǎn)品)、RNasin 0.5 μL、ddH2O 7 μL。42℃反應 60 min后,95℃ 5 min滅活反轉(zhuǎn)錄酶,反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物置于-20℃冰箱保存或立即進行下游實驗。

1.2.2實時熒光定量聚合酶鏈反應(qRT-PCR)根據(jù)文獻 合成p53基因引物序列，使用NCBI數(shù)據(jù)庫進行nm23-H1和β-actin序列的查找，采用Primer 5.0進行引物設計，引物由上海捷瑞生物有限公司合成，序列見表1。用qRT-PCR方法對子宮內(nèi)膜異位癥異位內(nèi)膜組織和正常子宮內(nèi)膜組織中的nm23-H1和p53表達進行定量檢測。qRT-PCR反應采用Maxima SYBR Green/ROX qPCR 試劑盒進行，體系12 μL，置于ABI-7500 PCR儀上50℃ 2 min，95℃ 10 min 后95℃15 s、60℃1 min共40循環(huán)。以β-actin為內(nèi)參，用2-△△CT法計算相對定量結果。

表1qPCR實驗中的引物序列(5′→3′)

基因引物序列片段大小/bpβ-actinF-CTCCATCTGGCCTCGCTGT267R-GCTGTCACCTTCACCGTTCCnm23-H1F-GACCGTCCATTCTTTGCC93R-GCCCGTCTTCACCACATTp53F-AGGCCTTGGAACTCAAGGAT85R-CCCTTTTTGGACTTCAGGTG

2結果

2.1nm23-H1基因在子宮內(nèi)膜異位癥中的表達nm23-H1基因在子宮內(nèi)膜異位癥組和正常對照組中mRNA表達水平分別為0.67±0.29和1.23±1.15，子宮內(nèi)膜異位癥異位內(nèi)膜組織中nm23-H1的mRNA表達水平低于正常對照組，差異有統(tǒng)計學意義(t=2.575，P<0.05)，見表2。

2.2p53基因在子宮內(nèi)膜異位癥中的表達p53基因在子宮內(nèi)膜異位癥和正常對照組中的mRNA表達水平分別為0.51±0.42和1.62±2.2，子宮內(nèi)膜異位癥異位內(nèi)膜組織中p53基因的mRNA表達低于正常對照組，差異有統(tǒng)計學意義(t=2.708，P<0.05)，見表2。

表2子宮內(nèi)膜異位癥組和正常對照組中nm23-H1基因和p53基因mRNA表達強度的比較

組別nnm23-H1p53對照組301.23±1.151.62±2.2病例組300.67±0.290.51±0.42

2.3nm23-H1和p53基因表達的相關性子宮內(nèi)膜異位癥異位內(nèi)膜組織中nm23-H1基因和p53基因mRNA表達水平均下調(diào)，兩者在子宮內(nèi)膜異位癥患者的異位內(nèi)膜組織中的表達有一定的相關性(r=0.42，P=0.02)，正常對照組中nm23-H1基因和p53基因的表達無相關性(r=0.093，P=0.62)。

3討論

子宮內(nèi)膜異位癥是極具侵襲性和復發(fā)性、嚴重影響婦女健康和生活的婦科疑難病，目前致病機制仍不明確[1-3]。該病雖然是一種良性疾病，卻具有惡性腫瘤浸潤和轉(zhuǎn)移的特點，因而可能具有某些與癌癥相類似的發(fā)病機制，一些腫瘤轉(zhuǎn)移抑制基因在疾病的發(fā)生、發(fā)展中可能發(fā)揮一定的作用。

nm23基因是第一個被發(fā)現(xiàn)的腫瘤轉(zhuǎn)移抑制基因。已知nm23基因家族有10個成員：H1～H10，其中nm23-H1與腫瘤轉(zhuǎn)移關系密切[8-9]。研究證實nm23-H1基因與多種腫瘤的轉(zhuǎn)移潛能負相關，與病人生存期正相關[8-10]。其抑制腫瘤轉(zhuǎn)移的機制尚不明確[8-11]。

nm23-H1基因在子宮內(nèi)膜異位癥中的作用研究不多，Schneider等[12]的研究發(fā)現(xiàn)，在16例盆腔子宮內(nèi)膜異位癥患者中僅7例表達了nm23蛋白(陽性率為43.7%)，本實驗室前期研究結果[13]也顯示子宮內(nèi)膜異位癥中nm23-H1的mRNA和蛋白表達水平均低于各自的正常子宮內(nèi)膜對照組。本研究表明，nm23-H1基因在子宮內(nèi)膜異位癥異位內(nèi)膜組織中的表達下調(diào)，低于正常對照組，這與Schneider等及本實驗室前期研究結果一致，表明nm23-H1基因與子宮內(nèi)膜異位癥的發(fā)生有一定的關聯(lián)。

p53基因是迄今發(fā)現(xiàn)與腫瘤發(fā)生最相關的基因，野生型p53基因是重要的腫瘤抑制基因，參與細胞周期調(diào)控，與細胞增殖、凋亡相關。p53基因的突變和表達異常頻繁出現(xiàn)在人類多種癌癥中。p53基因是否在子宮內(nèi)膜異位癥中發(fā)揮作用仍是不明確的。Schneider等[12]使用免疫組織化學方法在子宮內(nèi)膜異位癥中未檢測到p53的表達。Govatati等[14]研究表明，子宮內(nèi)膜異位癥患者異位內(nèi)膜p53基因表達下調(diào)與印度婦女子宮內(nèi)膜異位癥發(fā)病風險相關。本研究發(fā)現(xiàn)異位內(nèi)膜組織中p53基因mRNA表達水平低于正常對照組，該基因表達的異常可能是子宮內(nèi)膜異位癥發(fā)病的一個重要機制。

Jung等[15]研究表明nm23-H1可直接與p53相互作用，增加p53核易位(nuclear translocation)，從而激活p53的功能。而p53基因作為雌激素受體的負性調(diào)控因子可能通過類固醇信號通路間接調(diào)節(jié)nm23-H1的表達[16]]。本實驗發(fā)現(xiàn)子宮內(nèi)膜異位癥異位內(nèi)膜組織中nm23-H1基因和p53基因mRNA表達水平均下調(diào)，兩者在子宮內(nèi)膜異位癥患者的異位內(nèi)膜組織中的表達有一定的相關性，而在正常對照組中兩者表達無相關性。子宮內(nèi)膜異位癥是雌激素依賴性疾病[1-3]，研究表明[17]]雌、孕激素可通過PIK3/Akt通道調(diào)節(jié)nm23-H1的表達。激素的改變可能通過影響nm23-H1基因的表達導致子宮內(nèi)膜異位癥的發(fā)生。在體內(nèi)高雌激素水平下，nm23-H1基因和p53基因可能相互協(xié)同、相互作用，共同促進子宮內(nèi)膜異位癥的發(fā)生。

子宮內(nèi)膜異位癥是多因素疾病，其發(fā)生、發(fā)展是一個復雜的過程,腫瘤轉(zhuǎn)移抑制基因和抑癌基因的表達失調(diào)可能在其中發(fā)揮重要的作用，對nm23-H1基因在子宮內(nèi)膜異位癥發(fā)生中的作用及其機制的研究可能為子宮內(nèi)膜異位癥的發(fā)病機制和臨床治療手段提供新的思路和分子標靶。

【參考文獻】

[1] BONOCHERcm,MONTENEGRO ML,ROSA E SILVA JC,et al.Endometriosis and physical exercises:a systematic review.Reprod BiEndocrinol，2014,6(12):4-9.

[2] EMRE A,AKBULUT S,YILMAZ M,et al.An unusual cause of acute appendicitis:Appendiceal endometriosis.Int J Surg Case Rep,2013,4(1):54-57.

[3] SILVA N,SENANAYAKE H,WADUGE V.Elevated levels of whole blood nickel in a group of Sri Lankan women with endometriosis:a case control study.BMC Res Notes,2013,6:13.

[4]孫青,孔麗娜.子宮內(nèi)膜異位癥與腫瘤轉(zhuǎn)移基因關系的研究進展.國外醫(yī)學遺傳學分冊,2004,27(3):184-187.

[5] STEEG PS,BEVILACQUA G,POZZATTI R,et al.ME.Altered expression of NM23,a gene associated with low tumor metastatic potential,during adenovirus2 Ela inhibition of experimental metastasis.Cancer Res,1988,48:6550-6554.

[6] XI PENG LONG,WU FANG BU,YUAN WANG,et al.Expression of p53 in the Effects of Artesunate on Induction of Apoptosis and Inhibition of Proliferation in Rat Primary Hepatic Stellate Cells.PLoS ONE,2011,6(10):e26500.

[7] HAQUES,YAN X J,ROSEN L,et al.Effects of prostaglandin E2 on p53 mRNA transcription and p53 mutagenesis during T-cell-independent human B-cell clonal expansion E.FASEB J,2014,28：627-643.

[8] JARRETT SG,NOVAK M,HARRIS N,et al.NM23 deficiency promotes metastasis in a UV radiation-induced mouse model of human melanoma.Clin Exp Metastasis,2013,30(1):25-36.

[9] ZHAO RONGZHI,GONG LEI,LI LIN,et al.nm23-H1 is a negative regulator of TGF-β1-dependent induction of epithelial-mesenchymal transition.Exp Cell Res,2013,319(5):740-749.

[10] MARINO N,MARSHALL JC,STEEG PS.Protein-protein interactions:a mechanism regulating the anti-metastatic properties of Nm23-H1.Naunyn Schmiedebergs Arch Pharmacol,2011,384:351-362.

[11] LIONELLO M,BLANDAMURA S,AGOSTINI M,et al.A prognostic role for Nm23-H1 in laryngeal carcinoma treated with postoperative radiotherapy:an introductory investigation.Eur Arch Otorhinolaryngol,2013,270(1):197-203.

[12] SCHNEIDER J,JIMENEZ E,RODRIGUEZ F,et al.c-myc,c-erb-B2,nm23 and p53 expression in human endometriosis.Oncol Rep,1998,5(1):49-52.

[13] 李鐵臣,孔麗娜,孫青,等.子宮內(nèi)膜異位癥中nm23-H1基因表達的意義.中國病理生理雜志,2007,23(1):116-119.

[14] GOVATATI S,CHAKRAVARTY B,DEENADAYAL M,et al.p53 and risk of endometriosis in Indian women.Genet Test Mol Biomarkers,2012,6(8):865-873.

[15] JUNG H,SEONG HA,HA H.NM23-H1 tumor suppressor and it interacting partner STRAP activate p53 function.J Biol Chem,2007,282(48):35293-35307.

[16] CHEN SHEN-LIANG,WU YI-SHIN,SHIEH HSIN-YING,et al.p53 is a regulator of the metastasis suppressor gene Nm23-H1.Mol Carcinog,2003,36:204-214.

[17] HUA KEQIN,DIN JINGXIN,CAO QI,et al.Estrogen and progestin regulate HIF-1alpha expression in ovarian cancer cell lines via the activation of Akt signaling transduction pathway.Oncol Rep,2009,21(4):893-898.

Expression and implication of nm23-H1 and p53 gene in endometriosis

WANG Genlian,LIN Aiqin,DUAN Renjie,LI Tiechen,SUN Qing

Department of Obstetrics and Gynecology,The first Affiliated Hospital of Wannan Medical College,Wuhu 241001,China

【Abstract】Objective：To investigate the mRNA expression level of nm23-H1 and p53 gene in subjects with normal endometrium or endometriosis for clarifying the roles of the two genes in the pathogenesis and development of endometriosis.Methods:Endometrium samples were retrospectively obtained from healthy women(n=30)and patients with endometriosis(n=30).Real-time quantitative PCR was performed to determine the mRNA expression level of nm23-H1 and p53 gene in the two groups,and the relationship between the two genes were analyzed.Results:By comparison with the normal endometrial tissues,patients with endometriosis had down-regulated mRNA expression levels of nm23-H1 and P53 gene(t=2.575,P=0.015 vs t=2.708,P=0.011)in which the two genes were correlated to a certain extent(r=0.42,P=0.02).Conclusion:Down-regulated levels of nm23-H1 gene and p53 gene may be associated with the occurrence and development of endometriosis,and nm23-H1 gene leading to endometriosis may be involved in the alteration of p53.However,the exact mechanism remains to be further clarified.

【Keywords】endometriosis;nm23-H1;p53;real-time quantitative PCR

文章編號：·基礎醫(yī)學·1002-0217(2016)01-0005-03

基金項目：安徽省高校省級自然科學研究重點項目(KJ2014A267)

收稿日期：2015-07-02

作者簡介：汪根蓮(1981-)，女，2013級碩士研究生，(電話)13605632467，(電子信箱)2603542847@qq.com;

【文獻標識碼】【中圖號】R 711.71A

孫青，女，副主任醫(yī)師，副教授，碩士生導師，(電子信箱)sunqingl@126.com,通訊作者.