1型糖尿病模型大鼠Meynert基底核神經(jīng)元凋亡及Bax與Bcl-2的蛋白表達(dá)

王　薇，趙　健，郭　靈

(1.皖南醫(yī)學(xué)院　解剖學(xué)教研室，安徽　蕪湖　241002；2.廣西醫(yī)科大學(xué)　解剖學(xué)教研室，廣西　南寧　530021)

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1型糖尿病模型大鼠Meynert基底核神經(jīng)元凋亡及Bax與Bcl-2的蛋白表達(dá)

王薇1，趙健1，郭靈2

(1.皖南醫(yī)學(xué)院解剖學(xué)教研室，安徽蕪湖241002；2.廣西醫(yī)科大學(xué)解剖學(xué)教研室，廣西南寧530021)

【摘要】目的：觀察1型糖尿病模型大鼠腦內(nèi)Meynert基底核神經(jīng)元凋亡以及凋亡相關(guān)因子Bax與Bcl-2的蛋白表達(dá)，探索1型糖尿病中樞神經(jīng)系統(tǒng)功能障礙的發(fā)生機(jī)制。方法：將24只成年健康Wistar大鼠隨機(jī)分為糖尿病組、載體組和正常組。腹腔注射溶于pH 4.4檸檬酸緩沖液的鏈脲佐菌素，建立1型糖尿病模型大鼠；載體組大鼠腹腔注射等體積的pH 4.4檸檬酸緩沖液；正常組不進(jìn)行任何處理。應(yīng)用TUNEL反應(yīng)技術(shù)和免疫組織化學(xué)方法，檢測(cè)各組大鼠腦Meynert基底核神經(jīng)元凋亡及凋亡相關(guān)因子Bax與Bcl-2基因的蛋白表達(dá)情況。結(jié)果：1型糖尿病大鼠腦Meynert基底核的Bax、TUNEL陽性細(xì)胞數(shù)明顯高于正常組和載體組(P<0.01)，但Bcl-2陽性細(xì)胞數(shù)明顯低于正常組和載體組(P<0.01)。結(jié)論：1型糖尿病能引起Meynert基底核中神經(jīng)元的凋亡及凋亡因子Bax的蛋白表達(dá)增加，同時(shí)使抗凋亡因子Bcl-2的蛋白表達(dá)減少。

【關(guān)鍵詞】1型糖尿病；細(xì)胞凋亡；Bax；Bcl-2；Meynert基底核

【DOI】10.3969/j.issn.1002-0217.2016.01.001

1型糖尿病是由于胰島β細(xì)胞破壞導(dǎo)致胰島素的絕對(duì)不足進(jìn)而引起血糖升高的一種疾病。而胰島素作為一種神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子，缺乏時(shí)常損害到腦內(nèi)的神經(jīng)細(xì)胞，導(dǎo)致中樞神經(jīng)系統(tǒng)功能障礙[1-2]。目前，1型糖尿病引起中樞神經(jīng)系統(tǒng)功能障礙的研究日益受到關(guān)注，但其機(jī)制尚不清楚。研究表明，Meynert基底核內(nèi)有大量的膽堿能神經(jīng)元，它發(fā)出的纖維投射到整個(gè)大腦新皮質(zhì)和杏仁體。并且有實(shí)驗(yàn)證明，破壞Meynert基底核可引起明顯的中樞神經(jīng)系統(tǒng)功能障礙[4-5]。目前有關(guān)1型糖尿病是否引起Meynert基底核膽堿能系統(tǒng)神經(jīng)元凋亡的研究甚少，因此本實(shí)驗(yàn)通過觀察1型糖尿病大鼠腦內(nèi)Meynert基底核是否有細(xì)胞凋亡發(fā)生及凋亡相關(guān)因子Bax和Bcl-2蛋白表達(dá)水平的變化，來探索1型糖尿病中樞神經(jīng)系統(tǒng)功能障礙的發(fā)生機(jī)制。

1材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物成年健康雄性Wistar大鼠24只，體質(zhì)量180～220 g，由廣西醫(yī)科大學(xué)醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。

1.2主要試劑及儀器鏈脲佐菌素(Streptozotocin，STZ)購(gòu)自Sigma公司；Bax與Bcl-2抗體、SP試劑盒、DAB顯色液及原位細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒(TUNEL)均購(gòu)自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司；One Touch Ⅱ血糖儀與Genuine血糖試紙均購(gòu)自美國(guó)強(qiáng)生公司；江灣Ⅰ型C大鼠立體定位儀購(gòu)自上海川沙花木農(nóng)機(jī)廠。

1.3實(shí)驗(yàn)分組及模型建立將24只Wistar大鼠隨機(jī)分成3組：糖尿病組、載體組和正常組，每組8只。糖尿病組：按已報(bào)道的方法，每10mg STZ溶解于1 mL的pH 4.4檸檬酸緩沖液中配置混合溶液，大鼠禁食24 h后，按5.5 mL/kg腹腔注射剛配制的混合溶液建立1型糖尿病大鼠模型。5 d后測(cè)定大鼠空腹血糖，以血糖≥16.7 mmol/L的大鼠作為模型成功標(biāo)準(zhǔn)；載體組大鼠腹腔注射等體積的檸檬酸緩沖液；正常組大鼠不作任何處理。

1.4TUNEL及免疫組織化學(xué)染色法1%戊巴比妥鈉腹腔注射麻醉，開胸暴露心臟和升主動(dòng)脈，4%多聚甲醛灌注固定，開顱后將大鼠正確地置于大鼠腦立體定位儀上，取出含有Meynert基底核的節(jié)段，固定24 h，石蠟包埋，連續(xù)切片，片厚5 μm，切片常規(guī)脫蠟至水。按照試劑公司提供的相應(yīng)說明書分別進(jìn)行TUNEL、Bax和Bcl-2的反應(yīng)和顯色步驟。陰性對(duì)照反應(yīng)用PBS替代相應(yīng)的一抗。常規(guī)脫水、透明，中性樹膠封片。

1.5細(xì)胞計(jì)數(shù)參照大鼠腦立體定位圖譜，在光鏡下對(duì)每只大鼠選擇相同腦冠狀切面各3張作為觀察對(duì)象，分別觀察分析并記錄相應(yīng)的TUNEL、Bax和Bcl-2陽性細(xì)胞數(shù)。

2結(jié)果

2.1各組大鼠血糖水平的變化與載體組和正常組比較，糖尿病組大鼠的血糖水平明顯升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)；但載體組和正常組相比較，兩組之間的血糖水平接近，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見表1。

組別血糖水平/(mmol/L)糖尿病組19.31±2.73*△載體組6.25±1.67正常組6.23±1.27F值115.394P值0.00

注：與載體組比較*P<0.01；與正常組比較△P<0.01。

2.2各組大鼠Meynert基底核Bax、Bcl-2及TUNEL陽性細(xì)胞的分布免疫組織化學(xué)結(jié)果顯示，TUNEL、Bax及Bcl-2陽性產(chǎn)物均呈棕黃色，TUNEL主要表達(dá)于細(xì)胞核，而Bax或Bcl-2主要表達(dá)于細(xì)胞漿。各組Meynert基底核中均可見TUNEL、Bax和Bcl-2陽性細(xì)胞，細(xì)胞輪廓清晰可見。陰性對(duì)照不顯色。

與載體組和正常組比較，糖尿病組Meynert基底核的Bax和TUNEL陽性細(xì)胞數(shù)顯著增加，而Bcl-2陽性細(xì)胞數(shù)則顯著下降，各組間的數(shù)據(jù)差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。但載體組與正常組相比較，各組數(shù)據(jù)均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。 見表2、圖1。

組別BaxBcl-2TUNEL細(xì)胞數(shù)/(個(gè)/高倍視野)灰度值細(xì)胞數(shù)/(個(gè)/高倍視野)灰度值細(xì)胞數(shù)/(個(gè)/高倍視野)灰度值糖尿病組38.83±5.35*△138.66±12.80*△21.85±4.44*△168.94±7.69*△39.13±3.56*△69.50±12.97*△載體組19.88±3.06172.19±10.0939.31±3.75140.06±5.4719.88±2.80122.62±4.16正常組18.96±3.94171.25±4.9438.84±4.80132.11±5.6919.63±4.07122.44±8.80F值56.39130.16341.82770.67280.98085.583P值0.0000.0000.0000.0000.0000.000

注：與載體組比較*P<0.01；與正常組比較△P<0.01。

A1、B1、C1分別為糖尿病組、載體組和正常組Bax陽性細(xì)胞的分布； A2、B2、C2分別為糖尿病組、載體組和正常組Bcl-2陽性細(xì)胞的分布；

A3、B3、C3分別為糖尿病組、載體組和正常組TUNEL陽性細(xì)胞的分布。

圖1各組大鼠Meynert基底核Bax、Bcl-2和TUNEL陽性細(xì)胞(免疫組織化學(xué)染色×400)

3討論

凋亡相關(guān)基因可分為抗凋亡和促凋亡兩大類，其中最經(jīng)典的代表分別為Bax與Bcl-2，他們?cè)诰€粒體介導(dǎo)的內(nèi)源性細(xì)胞凋亡通路中發(fā)揮著重要作用。在正常情況下，Bax與Bcl-2之間保持一定的比例，并以Bcl-2/Bax異源二聚體的形式存在，從而抑制凋亡，維持著細(xì)胞的生存；而病理原因可以誘導(dǎo)Bax的高表達(dá)，Bcl-2的低表達(dá)，增加Bax同源二聚體的形成，Bcl-2與Bax之間的比例下降，便促使細(xì)胞凋亡的發(fā)生。因此Bax與Bcl-2兩者的比值大小決定了細(xì)胞是否啟動(dòng)凋亡信號(hào)或者是否能進(jìn)入凋亡的狀態(tài)。在凋亡早期，細(xì)胞就發(fā)生了DNA的斷裂，而TUNEL細(xì)胞凋亡檢測(cè)法就是檢測(cè)DNA斷裂點(diǎn)的凋亡定量檢測(cè)方法，能夠較早檢測(cè)到細(xì)胞凋亡的發(fā)生[10]。綜上所述，本研究采用TUNEL、Bax和Bcl-2作為凋亡檢測(cè)指標(biāo)來觀察1型糖尿病大鼠Meynert基底核中細(xì)胞凋亡及凋亡基因蛋白表達(dá)的變化是相對(duì)合理的。

胰島β細(xì)胞凋亡加速引起胰島素分泌絕對(duì)不足是1型糖尿病發(fā)病的主要原因。研究發(fā)現(xiàn)，胰島素是中樞神經(jīng)系統(tǒng)主要的神經(jīng)生長(zhǎng)因子和神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子，具有保護(hù)神經(jīng)元的發(fā)育生長(zhǎng)、促進(jìn)神經(jīng)遞質(zhì)的合成和阻止細(xì)胞凋亡發(fā)生的功能，所以胰島素的缺乏便有可能導(dǎo)致神經(jīng)元功能失常，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的發(fā)生[11]。另外，1型糖尿病引起的持續(xù)性高血糖可以通過一系列的連鎖反應(yīng)，如降低Na+-K+-ATP酶的活性、阻止?fàn)I養(yǎng)物質(zhì)的運(yùn)輸、使腦血管壁增厚、促進(jìn)腦血栓形成等負(fù)性因素導(dǎo)致腦組織缺血以及結(jié)構(gòu)功能的損害[12-13]。

Meynert基底核內(nèi)聚集的膽堿能神經(jīng)元參與覺醒、學(xué)習(xí)和記憶等多種生理功能[3-5]。當(dāng)這些膽堿能神經(jīng)元減少時(shí)，膽堿乙酰轉(zhuǎn)移酶活性降低，神經(jīng)遞質(zhì)乙酰膽堿的合成和釋放減少，向大腦皮質(zhì)發(fā)出的興奮性神經(jīng)沖動(dòng)減少，勢(shì)必會(huì)影響到中樞神經(jīng)系統(tǒng)的正常功能，繼而引起中樞神經(jīng)系統(tǒng)功能障礙[14-15]。那么1型糖尿病能否改變凋亡相關(guān)基因Bax和Bcl-2的蛋白表達(dá)，繼而誘發(fā)Meynert基底核神經(jīng)元凋亡值得探討。因此，本研究建立了1型糖尿病模型并進(jìn)行了相關(guān)實(shí)驗(yàn)，其結(jié)果顯示：在400倍光學(xué)顯微鏡下觀察Meynert基底核，發(fā)現(xiàn)1型糖尿病組的TUNEL、Bax陽性細(xì)胞數(shù)均較載體組和正常組顯著增加(P<0.01)；而Bcl-2陽性細(xì)胞數(shù)則較載體組和正常組顯著降低(P<0.01)，據(jù)此推測(cè)1型糖尿病導(dǎo)致的胰島素缺乏和高血糖使Bax基因表達(dá)上調(diào)，而Bcl-2基因表達(dá)下調(diào)，促使凋亡程序的啟動(dòng)，Meynert基底核內(nèi)的膽堿能神經(jīng)元進(jìn)入凋亡狀態(tài)，大量神經(jīng)元自發(fā)性死亡，導(dǎo)致神經(jīng)元數(shù)量銳減，進(jìn)而干擾中樞神經(jīng)系統(tǒng)正常功能，最終導(dǎo)致中樞神經(jīng)系統(tǒng)功能障礙的發(fā)生。

綜上所述，凋亡基因Bax與抗凋亡基因Bcl-2在Meynert基底核內(nèi)表達(dá)失調(diào)引起的神經(jīng)元凋亡在1型糖尿病中樞神經(jīng)系統(tǒng)功能障礙的發(fā)生發(fā)展過程中可能扮演著重要的角色，但兩種凋亡相關(guān)基因?qū)?型糖尿病Meynert基底核神經(jīng)元進(jìn)行調(diào)控的分子機(jī)制尚未完全明確，需要進(jìn)一步深入研究。

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Neuron apoptosis and Bax/Bcl-2 protein expression in the nucleus basalis of Meynert in rats with type 1 diabetes

WANG Wei,ZHAO Jian,GUO Ling

Department of Anatomy,Wannan Medical College,Wuhu 241002,China

【Abstract】Objective：To observe neuron apoptosis and Bax and Bcl-2 protein expression in the nucleus basalis of Meynert in rats with type 1 diabetes for exploring the mechanisms of central nervous system dysfunction in type 1 diabetes.Methods:Twenty-four Wistar rats were randomized into group of diabetes,vehicle and normal.Type 1 diabetic model rats were induced by intraperitoneal injection of streptozotocin dissolved in citrate buffer solution(pH4.4).Rats in vehicle group were given equal volume of the same buffer,and normal controls were free of any treatment.Terminal-deoxynucleotidyl-transferase-mediated-dUTP nick and labeling(TUNEL)technique and immunohistochemical methods were used to detect the neuron apoptosis in the nucleus basalis of Meynert in each group of rats.Results:The number of Bax immunereactive(Bax-IR)neurons and TUNEL-positive neurons in the nucleus basalis of Meynert was significantly higher,yet the count of Bcl-2 IR neurons was markedly lower,in type 1 diabetic group than the vehicle and normal groups(P<0.01).Conclusion:Type 1 diabetic rats may be complicated with apoptosis of nucleus basalis of Meynert and up-regulated Bax expression,yet decrease of Bcl-2 protein expression.

【Keywords】type 1 diabetes;cell apoptosis;Bax;Bcl-2;nucleus basalis of Meynert

文章編號(hào)：·基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)·1002-0217(2016)01-0001-04

基金項(xiàng)目：皖南醫(yī)學(xué)院中青年科研基金項(xiàng)目(WK201108)

收稿日期：2015-07-24

作者簡(jiǎn)介：王薇(1985-)，女，助教，(電話)15955389737，(電子信箱)wangweiaqhn@163.com；

【文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼】【中圖號(hào)】R 587.1A

郭靈，男，教授，(電子信箱)drguolinggx@aliyun.com，通訊作者.