中心組合響應(yīng)面優(yōu)化里氏木霉B4菌產(chǎn)纖維素酶培養(yǎng)基組成研究*

屈海峰，白殿國，于占春，岳 軍，王繼艷，寧艷春，李愛力，徐友海，胡世洋

(1.中國石油吉林石化公司 研究院，吉林 吉林 132021；2.吉林燃料乙醇有限責(zé)任公司，吉林 吉林 132101；3.欽州出入境檢驗檢疫局，廣西 欽州 535000)

化石燃料燃燒所排放的大量二氧化碳，造成了嚴(yán)重的溫室效應(yīng)，同時機(jī)動車尾氣也是引起霧霾的原因之一。我國是一個農(nóng)業(yè)大國，每年的農(nóng)作物秸稈量約達(dá)7億t，除少部分被利用外，大部分被焚燒，造成了嚴(yán)重的環(huán)境污染。而將秸稈轉(zhuǎn)化為燃料乙醇，替代部分汽油使用，可以減少二氧化碳的排放，同時也可解決因秸稈焚燒所造成的環(huán)境問題[1-2]。

將木質(zhì)纖維素材料轉(zhuǎn)化為乙醇，首先需要將大分子狀態(tài)的纖維素轉(zhuǎn)化為酵母可以利用的可發(fā)酵性糖。主要途徑有兩條：一是通過酸法水解木質(zhì)纖維素材料為可發(fā)酵性糖，另一條途徑是生物轉(zhuǎn)化法。由于酸法存在一系列的問題，生物轉(zhuǎn)化法已成為主要的發(fā)展方向[3-4]。

里氏木霉是常用于發(fā)酵生產(chǎn)纖維素酶的菌株，能夠分泌較多的胞外蛋白，酶系構(gòu)成中外切酶組分占到蛋白含量的60%～70%，且比較均衡[5-6]。但是受制于較低的酶活性，如何提高里氏木霉的產(chǎn)酶能力仍是研究的重點(diǎn)。一方面可對菌株進(jìn)行遺傳改造[7-8]，另一方面可通過發(fā)酵控制策略的研究，優(yōu)化發(fā)酵條件，充分發(fā)揮菌株的性能[9-10]。碳源、氮源是影響里氏木霉產(chǎn)纖維素酶的兩個主要因素，很多文獻(xiàn)研究了碳、氮源種類對于酶活的影響，但多使用昂貴的纖維素粉、乳糖、酵母粉、玉米漿、豆餅粉，這些物質(zhì)的使用增加了纖維素酶的生產(chǎn)成本[11-12]，因此有必要研究使用廉價的碳、氮源替代，從而降低成本。

1 實驗部分

1.1 材料、試劑與儀器

菌種為里氏木霉B4菌株：由本實驗室保存，保存條件為4 ℃，馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基(PDA培養(yǎng)基)，保存過程中每月將菌株進(jìn)行重復(fù)培養(yǎng)。

葡萄糖、KH2PO4、(NH4)2SO4、MgSO4、CaCO3、NaNO3，MnSO4·H2O、ZnSO4·7H2O、CoCl2·6H2O、FeSO4·7H2O：均為分析純，玉米芯粉、麥麩：市售。

電熱恒溫水浴鍋：HHS，上海博訊實業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠；振蕩培養(yǎng)箱：BS-1E，金壇市富華儀器有限公司；離心機(jī)：Anke TGL-16G，上海安亭科學(xué)儀器廠；微孔板光譜儀：Spectra Max Plus 384，美國 Molecular Device；超凈工作臺：蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司。

種子培養(yǎng)基(1 L)：20 g葡萄糖、3 g KH2PO4、5 g(NH4)2SO4、0.5 g MgSO4、3 g CaCO3、2 g NaNO3，上述物質(zhì)加水配制成1 L溶液，pH值自然，500 mL的三角瓶中裝入100 mL培養(yǎng)基，以上培養(yǎng)基均勻配制分裝后121 ℃滅菌30 min。

產(chǎn)酶培養(yǎng)基(1 L)：培養(yǎng)基中含有不同含量的玉米芯粉、麥麩、(NH4)2SO4，其余與種子培養(yǎng)基相同，500 mL的三角瓶中裝入100 mL培養(yǎng)基，以上培養(yǎng)基均勻配制分裝后121 ℃滅菌30 min。

微量元素濃縮液(1 L)：250 mg MnSO4·H2O、360 mg ZnSO4·7H2O、370 mg CoCl2·6H2O、750 mg FeSO4·7H2O，上述物質(zhì)加水配制成1 L溶液。

1.2 實驗方法

1.2.1 種子制備

加入孢子懸液1 mL(孢子數(shù)量控制在106～108/mL)到滅菌后的種子培養(yǎng)基中，接種后置于恒溫振蕩培養(yǎng)箱中28 ℃，180 r/min下培養(yǎng)40 h，作為一級種子備用。

1.2.2 產(chǎn)酶培養(yǎng)

吸取10 mL種子液在無菌操作條件下，加入到產(chǎn)酶培養(yǎng)基中，放入恒溫振蕩培養(yǎng)箱中于28 ℃，180 r/min下培養(yǎng)96 h，培養(yǎng)過程中，每24 h取樣并測定濾紙酶活。

1.2.3 實驗設(shè)計

采用Minitab 15進(jìn)行中心組合設(shè)計及統(tǒng)計學(xué)分析，利用Statistica 6.0軟件進(jìn)行響應(yīng)面的分析。

1.2.4 濾紙酶活測定

濾紙酶活(FPase)的測定：將Waterman 1號濾紙裁剪成1 cm×6 cm大小的長條形狀，質(zhì)量為49.5～50.5 mg，折疊成M狀放入25 mL比色管底部，加入 pH=4.8的醋酸-醋酸鈉緩沖液1 mL，然后加入0.5 mL稀釋適當(dāng)倍數(shù)的粗酶液并混勻，對照為煮沸10 min滅活的相同稀釋倍數(shù)的粗酶液。于50 ℃水浴水解60 min，然后用3,5-二硝基水楊酸(DNS)法測定生成的還原糖(以葡萄糖計)。FPase酶活力的定義是以上述條件下每分鐘水解底物產(chǎn)生1 μmol還原糖所需的酶量為一個酶活力單位(IU)。

2 結(jié)果與討論

2.1 三因素中心組合優(yōu)化

碳源、氮源是影響里氏木霉產(chǎn)纖維素酶的主要因素[13-14]，其中硫酸銨與豆餅粉是纖維素酶發(fā)酵過程中常用的兩種氮源，兩種氮源中硫酸銨為生理酸性鹽，而豆餅粉被利用后，發(fā)酵液pH值呈堿性，里氏木霉的最適生長pH值在4～5，pH值過高會造成菌絲生長裂解，產(chǎn)酶量下降。相關(guān)研究表明在里氏木霉產(chǎn)纖維素酶的過程中，相比于有機(jī)氮源[15]，無機(jī)氮源硫酸銨已經(jīng)足夠菌絲的生長及酶的分泌，并且采用廉價易得的麥麩及玉米芯代替價格較高的纖維素粉為碳源，可以降低成本。

實驗過程中以麥麩、玉米芯、硫酸銨為主要因素，以濾紙酶活為響應(yīng)值進(jìn)行了三因素五水平的優(yōu)化，并使用Statistic 6.0與Minitab 15軟件進(jìn)行響應(yīng)面及統(tǒng)計學(xué)分析，因子及水平設(shè)計見表1，實驗結(jié)果及預(yù)測結(jié)果對比見表2。

表1 三因素中心組合水平表

表2 中心組合因子水平設(shè)計及實驗結(jié)果預(yù)測結(jié)果對比表

續(xù)表

響應(yīng)面法可以直觀看出因素對于響應(yīng)值的影響，并且可以得出進(jìn)一步的優(yōu)化方向或是最佳工藝條件，為了對里氏木霉產(chǎn)纖維素酶的條件進(jìn)行優(yōu)化，利用Statistic 6.0軟件分析了中心組合三個因素：ρ(麥麩)、ρ(玉米芯)和ρ(硫酸銨)對響應(yīng)值濾紙酶活的影響，結(jié)果見圖1～圖3。通過對響應(yīng)曲面和等高線圖的分析可以看出ρ(麥麩)、ρ(玉米芯)和ρ(硫酸銨)這三個因素對于濾紙酶活的影響趨勢。

圖1 中心組合響應(yīng)面圖(硫酸銨與玉米芯交互作用)

圖2 中心組合響應(yīng)面圖(麥麩與玉米芯交互作用)

圖3 中心組合響應(yīng)面圖(麥麩與硫酸銨交互作用)

由圖1可知，當(dāng)ρ(硫酸銨)由低水平增加到高水平時酶活有增加的趨勢，固定硫酸銨用量，ρ(玉米芯)無論在低水平與高水平時都不利于產(chǎn)酶，較高的產(chǎn)酶區(qū)間是ρ(玉米芯)=40～60 g/L。

由圖2可知，ρ(玉米芯)在高水平和低水平時，酶活都處在較低值，從三維曲面圖中可以得出，當(dāng)ρ(玉米芯)=50 g/L時，響應(yīng)曲面的顏色最深，表示酶活處于最高值，因此為取得較高的酶產(chǎn)量，ρ(玉米芯)=50 g/L為宜；固定ρ(玉米芯)，ρ(麥麩)由低水平增加到高水平時酶活逐漸降低，因此為提高酶的產(chǎn)量應(yīng)減少麥麩的用量。

由圖3可知，當(dāng)ρ(麥麩)處于高水平而ρ(硫酸銨)處于低水平時酶活處于較高值，ρ(麥麩)處于高水平增加硫酸銨的用量會降低濾紙酶活；ρ(麥麩)與ρ(硫酸銨)同時處于低水平時酶活也處于較低值；當(dāng)ρ(麥麩)處于低水平而ρ(硫酸銨)處于高水平時，酶活趨于增加的趨勢。因此為增加濾紙酶活應(yīng)增加硫酸銨的用量而相應(yīng)的降低麥麩的用量。ρ(玉米芯)、ρ(硫酸銨)和ρ(麥麩)三個因素中，ρ(麥麩)對產(chǎn)酶的影響最小，應(yīng)降低麥麩的用量。

利用Minitab軟件對于ρ(玉米芯)、ρ(硫酸銨)和ρ(麥麩)三因素中心組合實驗結(jié)果進(jìn)行了統(tǒng)計學(xué)分析，結(jié)果見表3。

表3 中心組合優(yōu)化以濾紙酶活為響應(yīng)值的結(jié)果分析

表4 以濾紙酶活為響應(yīng)值的擬合模型統(tǒng)計學(xué)分析

2.2 兩因素中心組合優(yōu)化

在三因素的中心組合優(yōu)化實驗中，發(fā)現(xiàn)麥麩的加入量在低水平時對產(chǎn)酶更加有利，因此培養(yǎng)基中不添加麥麩，只對ρ(玉米芯)與ρ(硫酸銨)進(jìn)行兩因素五水平的全因子優(yōu)化，利用Minitab軟件進(jìn)行實驗設(shè)計，各水平實驗值見表5。實驗結(jié)果與模型的預(yù)測值見表6。

表5 二因素中心組合水平表

表6 二因素全因子水平設(shè)計及實驗結(jié)果預(yù)測結(jié)果對比表

利用Statistic 6.0軟件對ρ(玉米芯)、ρ(硫酸銨)以及濾紙酶活為響應(yīng)值時進(jìn)行了響應(yīng)面分析(見圖4)。通過對響應(yīng)曲面和等高線圖的分析可以看出，當(dāng)ρ(玉米芯)<55 g/L時，無論硫酸銨在低水平與高水平時酶活都處于較低值，只有ρ(玉米芯)>55 g/L時，濾紙酶活才逐漸增加。較適宜的ρ(硫酸銨)=12 g/L，繼續(xù)增加硫酸銨的用量導(dǎo)致酶活下降。

圖4 二因素全因子響應(yīng)面(玉米芯與硫酸銨交互作用)

表7 中心組合優(yōu)化以濾紙酶活為響應(yīng)值的結(jié)果分析

表8 以濾紙酶活為響應(yīng)值的擬合模型統(tǒng)計學(xué)分析

3 結(jié) 論

采用廉價易得的碳源玉米芯、氮源硫酸銨，經(jīng)過三因素五水平及兩因素五水平兩輪實驗，里氏木霉產(chǎn)酶培養(yǎng)條件得到了優(yōu)化。僅采用硫酸銨做為氮源也可以滿足菌體的生長與產(chǎn)酶需求，模型預(yù)測的最優(yōu)組成為ρ(玉米芯)=75 g/L、ρ(硫酸銨)=12 g/L，此條件下濾紙酶活為3.12 FPU/mL,較優(yōu)化前提高58.38%，回歸模型的p<0.05，模型顯著，可以用于對實驗結(jié)果的預(yù)測。

參 考 文 獻(xiàn)：

[1] 趙建，曲音波.木質(zhì)纖維素資源生物精煉技術(shù)研究進(jìn)展[J].生命科學(xué),2014(5):489-496.

[2] 方詡，秦玉琪，李雪芝，等.纖維素酶與木質(zhì)纖維素生物降解轉(zhuǎn)化的研究進(jìn)展[J].生物工程學(xué)報,2010，26(7):864-869.

[3] 岳軍，胡世洋，恵繼星，等.木質(zhì)纖維素材料預(yù)處理研究進(jìn)展[J].現(xiàn)代化工,2014,34(10):31-35.

[4] 劉凱，戴莉，方詡，等.纖維素酶生產(chǎn)技術(shù)的研究進(jìn)展[J].生物產(chǎn)業(yè)技術(shù),2014(3):59-65.

[5] 王涫，王明鈺，穆子銘，等.里氏木霉纖維素酶生產(chǎn)工藝的優(yōu)化[J].黑龍江農(nóng)業(yè)科學(xué),2012(5):108-112.

[6] ROBYN PETERSON,HELENA NEVALAINEN.TrichodermareeseiRUT C30 thity years of strain improvement[J].Microbiology，2012，158：58-68.

[7] WANG S W，LIU G，WANG J，et al.Enhancing cellulse production inTrichodermareeseiRUT C30 through combined manipulation of activating genes[J].Jurnal of industrial microbiology biotechnology，2013,40:633-641.

[8] WU G H，HE R L，JIA W D，et al.Strain improvement and process optimization ofTrichdermareeseiRUT C30 for enhanced cellulase production[J].Biofuels,2012,2:545-555.

[9] LI C，YANG Z H，HE R L.Effect of pH on cellulase production and morphology ofTrichodermareeseiand the application in cellulosic material hydrolysis[J].Journal of Biotechnology，2013，168:470-477.

[10] MA L J，LI C，YANG Z H.Kinetic studies on batch cultivation ofTrichodermareeseiand application to enhance cellulase production by fed-batch fermentation[J].Journal of Biotechnology,2013，166：192-197.

[11] SARAVANAN P,MUTHUVELAYUDHAM R,RAJESH KANNAN R,et al.Optimization of cellulase production usingTrichodermareeseiby RSM and comparison with genetic algorithm[J].Front Chem Sci Eng，2012,6(4):443-452.

[12] SHAHRIARINOUR,M WAHAB MNA.,MOHAMAD R,et al.Effect of medium composition and cultural conditionon cellulase production byAspergillusterreus[J].African Journal of Biotechnology,2011,10(38):7459-7467.

[13] 伍紅，陳秀珍，董志揚(yáng)，等.碳源對里氏木霉QM9414胞外酶基因表達(dá)的影響[J].西南民族大學(xué)學(xué)報(自然科學(xué)版),2011,37(3):411-418.

[14] 勇強(qiáng)，李樹炎，陳牧，等.氮源對里氏木霉木聚糖酶和纖維素酶生物合成的影響[J].林產(chǎn)化學(xué)與工業(yè)，2004，24(3):7-11.

[15] DIVANERY RODRIGUEZ,GOMEZ TIMOTHY,JOHN HOBLEY.Is an organic nitrogen source needed for cellulase production byTrechodermareeseiRUT C30?[J].World J Microbial Biotechnol，2013，29:2157-2165.