肝素結合表皮生長因子對部分肝移植大鼠肝細胞CyclinD1表達的影響

周立新，蘇繼欽，王茂林，嚴輝弟，林培藝

廈門市第二醫院肝膽外科，福建 廈門 361021

肝素結合表皮生長因子對部分肝移植大鼠肝細胞CyclinD1表達的影響

周立新，蘇繼欽，王茂林，嚴輝弟，林培藝

廈門市第二醫院肝膽外科，福建 廈門 361021

目的 觀察肝素結合表皮生長因子(heparin-binding epidermal growth falrtor like growth factor, HB-EGF)對部分肝移植大鼠肝細胞CyclinD1表達的影響，并探討其促進肝再生的機制。方法 首先采用改良的“兩袖套”法構建大鼠部分(60%)肝移植模型，共75只，受體隨機平均分為A、B、C三組。其中，A組經皮下注射生理鹽水(100 mg/kg)，B組皮下注射HGF(100 mg/kg)，C組為皮下注射HB-EGF(100 mg/kg)，1次/d。手術后第1天 、第2天 、第3天 、第5天和第7天各處死5只受體大鼠，采用實時熒光定量PCR、Western blotting 檢測肝組織中CyclinD1 mRNA及蛋白的表達。結果 RT-PCR 檢測結果表明，C組術后第1天CyclinD1 mRNA表達就達到高峰，且顯著高于A、B組(P<0.05)，之后1周逐漸降低；Western blotting 檢測結果表明，三組CyclinD1 蛋白表達水平均有上升，但C組術后第1天即達到高峰，且顯著高于A、B組(P<0.05)。結論 HE-EGF可能通過上調肝移植后肝細胞 CyclinD1 的表達來促進肝再生。

肝素結合表皮生長因子；部分肝移植；肝再生；CyclinD1

肝素結合表皮生長因子(heparin-binding epidermal growth factor like growth factor, HB-EGF)是一種新的生長因子，屬于完全促有絲分裂原，由Besner等[1-2]在1990年首次在人巨噬細胞培養物中分離得到。研究表明，HB-EGF對大鼠部分肝移植后的肝再生有明顯的促進作用，且其促進作用優先于肝細胞生長因子(hepatocyte growth factor, HGF)。但其具體機制尚不明確。本實驗外源性HB-EGF和HGF注入部分肝移植大鼠模型，應用RT-PCR及Western blotting方法檢測實驗后細胞周期因子CyclinD1 mRNA和蛋白表達的變化，進一步認識HB-EGF對肝移植后肝細胞再生影響的分子機制。

1 材料與方法

1.1 主要試劑 肝素結合表皮生長因子(ProSpec，艾美捷科技有限公司)，肝細胞生長因子(sciencecell，美國)，總RNA提取試劑(Sigma-Aldrich， 德國)，低溶點瓊脂糖 (Amresco，美國)，DNA分子量標準(50 bp Ladder)(Amresco，美國)，引物合成與探針修飾(金斯瑞生物科技有限公司)，兔抗人CyclinD1多克隆抗體(上海篤瑪生物科技有限公司)，PCR 擴增儀(德國Bio-Bid公司) ，自動酶標檢測儀(美國Molecular Devices公司) 。

1.2 實驗動物及分組 健康、雄性Wistar大鼠，鼠齡體質量200～220 g，購自廈門大學醫學院實驗動物中心。且供、受體體質量差距控制在10 g以內。以改良的“兩袖套”法建立大鼠部分(60%)肝移植模型，受體隨機分為三組：A組：術后皮下注射生理鹽水(100 mg/kg，1次/d)；B組：術后皮下注射HGF(100 mg/kg，1次/d)；C組：術后皮下注射HB-EGF(100 mg/kg，1次/d)。分別于術后第1、2、3、5、7天各組處死5只受體大鼠。

1.3 半定量RT-PCR檢測CyclinD1 mRNA的表達 提取細胞總RNA，具體方法采用TRIzol一步提取, 保存于-70 ℃超低溫冰箱中。然后由AMV逆轉錄酶合成cDNA第1鏈，隨后進行PCR擴增。最后，取10 μl的產物在2%瓊脂糖凝膠中電泳，并使用凝膠成像系統觀察結果，與內參GAPDH灰度比值表示。

根據NCBI Genebank中大鼠HO-1基因序列，引物及探針的設計如下：RCYCLIND1F-2 5′-ACAACTCTATCCGCCCCGA-3′，RCYCLIND1R：5′-GAGGGTGGGTTGGAAATGA-3′ 217 bp; R-GAPDHF:5′-CCTCAAGATTGTCAGCAAT-3′，R-GAPDHR:5′-CCATCCACAGTCTTCTGAGT-3′, 141 bp。

1.4 Western blotting檢測CyclinD1蛋白的表達 首先組織塊稱重并粉碎，配置蛋白裂解液，然后裂解組織樣本，加入適當的緩沖液，隨后采用 BCA 蛋白測定試劑盒內蛋白的濃度。然后10% SDS-PAGE電泳分離，將蛋白轉至PVDF膜上，放置冰浴轉膜時間為60 min，之后微型臺式真空泵吸盡洗滌液，室溫搖動溫育2 h 進行封閉，封閉后的濾膜再分別與 CyclinD1 (稀釋比為 1∶200) 4 ℃ 溫育過夜。選擇IgG作為二抗(稀釋比為 1∶5 000)，洗膜后使用 beyoECL 發光法顯色，自動洗片機洗片，內參采用 GAPDH掃描 X 光片，最后計算灰度值。

2 結果

2.1 術后各組肝組織中CyclinD1mRNA的表達C組在術后第1天CyclinD1mRNA的表達明顯高于A組和B組(P<0.05)，之后逐漸降低；B組則在術后的第2天到達高峰，且明顯高于另外兩組(P<0.05)。術后第3天A組即達高峰，且明顯高于其他兩組(P<0.05)，而在其他各時間點，A組的表達相對減少，并低于B組和C組(P<0.05，見表1、圖1～2)。

表1 肝組織中CyclinD1 mRNA在各個時間點的表達情況(ΔCt)

Tab 1 The expression of CyclinD1 mRNA in every time point(ΔCt)

組別只數術后天數(d)12357A組255．1±0．327．1±0．478．5±0．523．7±0．221．4±0．08B組258．1±0．39?8．7±0．48?5．8±0．53?4．8±0．19?2．2±0．06?C組258．9±0．49?▲7．9±0．51?▲6．0±0．49?5．1±0．11?2．3±0．07?

注：與A組比較，*P<0.05；與B組比較，▲P<0.05。

圖1 GAPDH產物電泳圖; 圖2 CyclinD1的表達

Fig 1 The electrophoresis diagram of GAPDH； Fig 2 The expression of CyclinD1

2.2 術后各組肝組織中CyclinD1蛋白的表達 CyclinD1 蛋白表達水平在三組中的所有時間點均有升高，但C組術后第1天表達就達到高峰，且顯著高于另外兩組(P<0.05，見表 2、圖 3)。

組別例數術后天數(d)12357A組50．162±0．0450．287±0．0360．396±0．0950．492±0．0640．653±0．016B組50．151±0．0450．248±0．0180．336±0．0450．411±0．0240．582±0．089C組50．332±0．069?▲0．343±0．0260．331±0．0750．343±0．0510．398±0．076

注：與A組比較，*P<0.05；與B組比較，▲P<0.05。

圖3 Western blotting 檢測CyclinD1蛋白表達

Fig 3 The expression of CyclinD1 protein determined by Western blotting

3 討論

本實驗中，注入HB-EGF的部分肝移植小鼠，CyclinD1在 mRNA 和蛋白水平表達均有上調，與對照組比較差異顯著，與文獻報道[3]一致。表明CyclinD1 蛋白表達的上調，參與了HB-EGF促進肝移植后肝細胞再生的過程。

目前研究[4]表明，肝細胞能否順利通過細胞周期增殖階段( G1～S期) ，CyclinD1 起著關鍵的促進作用，并且作為肝細胞有絲分裂時，進入細胞周期( G1期) 的標識因子。CyclinD1 Pcdk4復合物，能夠磷酸化諸多抑制蛋白，比如Rb 和p130 等，以及對于E2F 活化釋放，起到誘導作用；而E2F對肝細胞通過G1的控制點起到主要推動作用，并最終進行有絲分裂。肝細胞通過G1后，依賴CyclinD1的調控作用，細胞周期循環將周而復始地進行。眾多研究[5]發現CyclinD1對于許多有絲分裂原而言，是主要的關鍵作用點，如生長因子HGF在活化ERK1/2后，通過激活AP21和NF2κB，從而上調CyclinD1表達[6]，這與本實驗的結果一致。

據報道,大鼠部分肝切除術后，CyclinD1 mRNA即開始大量表達，并在術后12 h達到高峰，且其蛋白表達也隨之增多，并于第1天表達到達峰值。Mathur等[7]研究證實HB-EGF通過Ras/Raf的途徑級聯激活MAPK激酶，而MAPK最終能夠誘導CyclinD1的表達和活性，支持我們的結果。另外，有研究發現，大鼠肝大部切除后，其再生肝臟組織中HB-EGF、HGF和TGF-α 均有表達，但HB-EGF早于HGF和TGF-α[7-8]，這也與我們的實驗結果一致。

我們認為HG-EGF促進肝移植后肝細胞再生的機制可能是誘導Ra的高表達，Ras被激活后，再級聯放大激活MAPK。隨后被激活的MAPK轉至細胞核內，直接激活轉錄因子。另外，MAPK還可以刺激Fos和Jun 等因子形成轉錄因子AP-1，并結合myc基因旁的特異的DNA序列，從而啟動轉錄myc基因產物，該轉錄因子能激活其他基因。最后，這些信號共同誘導CyclinD1的表達，并對肝細胞再生產生促進作用。另外，大鼠部分肝移植后由于凝血紊亂、機體應激等諸多因素的影響，使得很多促肝生長的細胞因子減少甚至消失，導致CyclinD1的表達降低，肝再生延遲，也間接地證明了我們的觀點。

[1]Besner G, Higashiyama S, Klagsbrun M. Isolation and characterization of a macrophage-derived heparin-binding growth factor [J]. Cell Regul, 1990, 1(11): 811-819.

[2]Higashiyama S, Abraham JA, Miller J, et al. A heparin-binding growth factor secreted by macrophage-like cells that is related to EGF [J]. Science, 1991, 251(4996): 936-939.

[3]Ongusaha PP, Kwak JC, Zwible AJ, et al. HB-EGF is a potent inducer of tumor growth and angiogenesis [J]. Cancer Res, 2004, 64(15): 5283-5290.

[4]Xia W, Wang XQ. Abstract 3055: Potential role of cyclin D1 in regulation of liver cancer stem cells [J]. Cancer Res, 2014, 74(19 Suppl): 3055-3055.

[5]Pestell RG. New roles of cyclin D1 [J]. Am J Pathol, 2013, 183(1): 3-9.

[6]Varela RM, Fernández RD, Martínez LN, et al. Impaired liver regeneration in mice lacking glycine N-methyltransferase [J]. Hepatology, 2009, 50(2): 443-452.

[7]Mathur A, Martin JF. Stem cells and repair of the heart [J]. Lancet, 2004, 364(9429): 183-192.

[8]Hu J, Srivastava K, Wieland M, et al. Endothelial cell-derived angiopoietin-2 controls liver regeneration as a spatiotemporal rheostat [J]. Science, 2014, 343(6169): 416-419.

(責任編輯：王全楚)

Effects of heparin-binding epidermal growth factor-like growth factor on CyclinD1 of hepatic cell after partial transplantation in rats

ZHOU Lixin, SU Jiqin, WANG Maolin, YAN Huidi, LIN Peiyi

Department of Hepatobiliary Surgery, the NO.2 Hospital of Xiamen, Xiamen 361021, China

Objective To observe effect of using heparin-binding epidermal growth factor-like growth factor (HB-EGF) on the expression of CyclinD1 of hepatic cell after partial transplantation in rats so as to explore its mechanism．Methods The Two-cuff technique was adopted firstly to construct liver transplantation model of rat part (60%), totally 75 rats. The receptors were divided averagely and randomly into 3 groups: group A, B and C. Then 100 mg/kg the 0.9% NaCl (group A), 100 mg/kg HGF (group B) and 100 mg/kg HB-EGF (group C) were administered, respectively. All groups were done once a day. Subsequently, 5 receptors rats died for each group on the 1st, 2nd, 3rd, 5th and 7th days after the operation. Real-time fluorescence quantitative PCR and Western blotting were used to detect expressions of CyclinD1 mRNA and protein in the hepatic tissue. Results The expression of CyclinD1 mRNA in liver tissue peaked in group C, was higher than other groups on the 1st day after operation. The expression of CyclinD1 protein was increased in 3 groups, but that in the group C was higher than that in other two groups on the 1st day．Conclusion HB-EGF can promote liver regeneration after partial liver transplantation in rats. The mechanism may be related with the increase of CyclinD1 mRNA and protein．

Heparin binding epidermal growth factor like growth factor; Partial liver transplantation; Regeneration; CyclinD1

廈門市科技計劃指導性項目(3502Z20139012)

周立新，博士，主任醫師，博士生導師，研究方向：肝膽外科臨床及基礎研究。E-mail：zhoulix318@163.com

10.3969/j.issn.1006-5709.2016.11.015

R575

A

1006-5709(2016)11-1267-03

2016-05-10