下調PRR11表達抑制胃癌HGC-27細胞增殖和侵襲

宋宗昌, 郭長升, 趙鵬飛, 唐家宏, 韓懷忠, 張立新, 沈利群, 郭春亮, 岳榮喜

解放軍第一五五中心醫院血液腫瘤科/開封市血液病學重點實驗室, 河南 開封 475003

下調PRR11表達抑制胃癌HGC-27細胞增殖和侵襲

宋宗昌, 郭長升, 趙鵬飛, 唐家宏, 韓懷忠, 張立新, 沈利群, 郭春亮, 岳榮喜

解放軍第一五五中心醫院血液腫瘤科/開封市血液病學重點實驗室, 河南 開封 475003

目的 研究富含脯氨酸蛋白11(Proline-rich protein 11，PRR11)表達對胃癌HGC-27細胞增殖和侵襲能力的影響，并初步探討相關分子機制。方法 利用載有PRR11 shRNA的慢病毒及空載體慢病毒轉染胃癌HGC-27細胞系，建立PRR11蛋白低表達細胞系及陰性對照細胞系。Western blotting方法檢測轉染后HGC-27細胞中PRR11蛋白表達；采用CCK-8和Transwell小室分別研究兩組細胞增殖與侵襲能力的差異。采用Western blotting檢測胃癌細胞中cyclin D1和MMP-2蛋白的表達。結果 PRR11蛋白低表達HGC-27細胞較對照組HGC-27細胞的增殖和侵襲能力減弱，PRR11蛋白低表達細胞中cyclinD1和MMP-2蛋白表達較少。結論 PRR11低表達介導的胃癌細胞增殖和侵襲能力減弱，可能與cyclinD1和MMP-2表達減少密切相關。

胃癌；PRR11；細胞增殖；細胞侵襲

胃癌是世界上第四大常見的惡性腫瘤，是引起腫瘤性死亡的第二大病因[1-2]。我國胃癌發病率居惡性腫瘤第3位，僅次于肺癌、肝癌。2014年，我國新增胃癌患者約32.5萬，其中男性約22.1萬，女性約10.4萬，并有逐年增加的趨勢。由于胃癌的篩查工作尚未在我國廣泛開展，得到早期診斷的患者較少，有效的治療手段有限，雖然近年來胃癌的治療效果有所提高，但整體狀況還不令人滿意。手術仍是胃癌根治的唯一方法，由于大多數胃癌在診斷時往往處于中晚期，失去手術根治的時機，只有選擇放、化療及靶向藥物等治療方法，效果很不理想，中位存活時間多在7～10個月[3-4]。因此尋找影響胃癌發生、發展的關鍵性生物大分子，對于胃癌的篩查、早期診斷、有效治療及準確判斷預后具有十分重要的意義。

富含脯氨酸蛋白11(Proline-rich protein 11, PRR11)基因位于人類染色體17q22，PRR11是一個富含脯氨酸的蛋白質，相對分子量為40 085 Da[5-6]。最初研究發現PRR11在肺癌組織中高表達，與肺癌的發生及進展密切相關，是肺癌患者的不良預后因素。進一步研究發現PRR11大量表達于細胞質，參與調節細胞周期進程，在細胞周期調節中具有非常重要的作用[7]。目前越來越多的研究顯示，PRR11在多種惡性腫瘤中高表達，如食管癌、乳腺癌、胰腺癌、肺癌、結腸癌、膽管癌等，而在相應正常組織中低表達，并且具有顯著差異；研究結果還表明PRR11高表達是這些腫瘤預后不良的重要因素之一[8]。 但在胃癌中的研究尚局限于其表達狀況與臨床病理特征的相關性分析方面，但其作用機制尚不清楚，本研究利用RNA干擾技術下調胃癌HGC-27細胞中PRR11基因表達，研究其表達下調對胃癌細胞增殖和侵襲的影響，并探討其可能的分子機制。

1 材料與方法

1.1 細胞株與試劑 胃癌HGC-27細胞株購自中國科學院上海細胞生物學研究所。RPMI-1640培養基購自Gibco公司；胎牛血清和胰蛋白酶購自杭州四季青生物工程材料有限公司；兔抗人PRR11、β-actin、cyclin D1和MMP-2抗體購自abcam公司；CCK-8試劑盒購自上海碧云天生物技術有限公司；細胞裂解液購自大連寶生物工程有限公司；transwell小室購自北京優尼康生物科技有限公司。含PRR11 shRNA 慢病毒及空載體慢病毒由上海GENECHEM公司提供。shRNA慢病毒中含有靶向PRR11 mRNA的siRNA(5′-ACGCAGGCCUUAAGGAGAATT-3′)，空載體慢病毒中含有一段無意義錯配序列作為陰性對照。

1.2 細胞培養和siRNA慢病毒轉染 胃癌HGC-27細胞培養于含10%胎牛血清的RPMI-1640培養液中，細胞覆蓋率為85%左右時，按說明書將含PRR11 shRNA的慢病毒及空載體慢病毒轉染胃癌HGC-27細胞。實驗細胞分為兩組：PRR11表達敲低組細胞(PRR11-KD細胞)、陰性對照組細胞(PRR11-NC細胞)。轉染后48 h Western blotting方法檢驗干擾效果。

1.3 細胞增殖分析 選擇轉染成功且生長狀態良好的PRR11-KD細胞及PRR11-NC細胞，以每孔1×104個細胞接種于96孔板內，每組設復孔3個，37 ℃、5%CO2孵箱培養48 h；更換等量新鮮培養液后，向每孔中加入10 μl CCK-8溶液，繼續培養2 h左右，然后用酶標儀檢測波長為450 nm的吸光度值。

1.4 Transwell小室實驗 將兩組細胞分別懸浮于含有0.2%胎牛血清的培養基中，以1×104個細胞/100 μl的規格依次接種于鋪好matrigel膠的transwell小室的上室中，每組細胞重復3個小室。下室中加入500 μl含5%胎牛血清的培養基，37 ℃培養20 h，取出Transwell小室，PBS沖洗2遍，5%戊二醛固定，加入0.1%結晶紫室溫下染色0.5 h，PBS沖洗2遍，棉球擦去上表面細胞，顯微鏡下觀察細胞數量，通過計算濾膜下層的細胞數評估其侵襲的細胞數量(每個小室選擇10個視野，100×)。

1.5 Western blotting 建立穩定的PRR11-KD細胞系及PRR11-NC細胞系后，收集選擇生長狀態良好、覆蓋率約85%的細胞，利用蛋白裂解液分別提取兩組細胞的總蛋白，BCA法測定蛋白濃度，將兩種蛋白溶液分別稀釋至濃度近似，進行SDS-聚丙烯酰氨凝膠電泳，轉移至PVDF膜上，5%脫脂牛奶封閉液，完全覆蓋PVDF膜，置搖床上震蕩封閉1 h，加入兔抗人Ⅰ抗(PRR11、β-actin、cyclinD1和MMP-2)(1∶5 000)，4 ℃ 冰箱過夜。次日，加入山羊抗兔IgGⅡ抗(1∶5 000)，室溫下搖床上反應1 h。將PVDF膜置于凝膠成像儀內，取化學發光顯色液試劑A和試劑B，按照1∶1比例混勻，滴加至PVDF膜上，至完全覆蓋，成像。利用Gene Tools軟件分析蛋白表達的灰度值，蛋白相對表達量為待測蛋白與β-actin蛋白的比值。

2 結果

2.1 PRR11 shRNA導致胃癌HGC-27細胞中PRR11表達下降 Western blotting結果顯示，PRR11-KD細胞和PRR11-NC細胞中PRR11均有表達，PRR11-KD細胞中PRR11表達量顯著低于PRR11-NC細胞(P<0.05)，PRR11-KD細胞中PRR11表達量僅為PRR11-NC細胞中PRR11表達量21%(見圖1)。

圖1 病毒轉染后兩組HGC-27細胞中PRR11表達

Fig 1 PRR11 expression of HGC-27 cells after viral transfection

2.2 PRR11表達下調導致胃癌HGC-27細胞增殖能力下降 在96孔板中，以每孔1×104個細胞同時培養PRR11-KD細胞及PRR11-NC細胞，24 h、48 h、72 h及96 h后利用CCK-8進行活細胞量檢測，結果顯示，與PRR11-NC細胞相比，PRR11-KD細胞增殖受到明顯抑制，差異具有統計學意義(P<0.05, 見圖2)。

2.3 PRR11表達下調導致胃癌HGC-27細胞侵襲能力下降 Transwell小室實驗結果顯示，與PRR11-NC細胞相比(細胞穿膜數為179.00±27.06)，PRR11-KD細胞(細胞穿膜數為73.67±13.61)的穿膜數量顯著減少(P=0.000)，提示PRR11-KD細胞侵襲能力下降。

圖2 PRR11表達下調抑制胃癌HGC-27細胞增殖

Fig 2 Down-regulation of PRR11 expression inhibited proliferation of HGC-27 cells

2.4 PRR11表達下調導致胃癌HGC-27細胞中cyclinD1和MMP-2表達下降 Western blotting檢測結果顯示，PRR11-KD細胞中cyclinD1和MMP-2相對表達量分別為0.15±0.04、0.31±0.09，PRR11-NC細胞中cyclinD1和MMP-2相對表達量分別為0.61±0.13、0.73±0.11。PRR11-KD細胞中cyclinD1 和MMP-2表達量顯著低于PRR11-NC細胞中的表達量(P<0.05, 見圖3)。

圖3 PRR11表達下調對胃癌HGC-27細胞中cyclinD1和MMP-2蛋白表達的影響

Fig 3 Down-regulation of PRR11 expression impacted the expressions of cyclinD1 and MMP-2 of HGC-27 cells

3 討論

PRR11基因是美國國家健康機構哺乳動物基因收集項目通過全部測序的方法，首次從人類全長cDNA中鑒定出來的一個蛋白質編碼基因[9-10]。人類基因命名委員會將其系統命名為HGNC:25619。該基因位于人類染色體17q22，包含51 211個堿基，含有10個外顯子及9個內含子[11-13]。PRR11基因位于17q23擴增區，該區拷貝數在乳腺癌、肺癌、腦瘤及卵巢癌等多種腫瘤細胞中顯著增加，且其擴增程度與上述腫瘤的發展、擴散及預后相關[14-15]。目前發現多個腫瘤相關基因也位于該區域，如RPS6KB1、BRIP1、TRIM37、PPM1D等[16-17]。

PRR11基因編碼蛋白PRR11是一個富含脯氨酸的蛋白，由360個氨基酸構成，相對分子量為40 085 Da。該蛋白分布于細胞質、細胞核及細胞骨架[18]。該蛋白的作用靶標可能為膜蛋白、胞質蛋白、轉錄因子、啟動子等與腫瘤產生、增殖、侵襲及轉移密切相關的蛋白及基因位點。

PRR11在多種惡性腫瘤的細胞增殖、周期進程、腫瘤浸潤和轉移中扮演著重要角色，為了初步闡明PRR11表達下調對胃癌細胞增殖和侵襲的影響，我們利用PRR11 shRNA慢病毒轉染胃癌HGC-27細胞，采用Western blotting技術測定轉染后PRR11表達差異，結果發現PRR11-KD細胞組中PRR11表達顯著低于PRR11-NC細胞組，提示PRR11 shRNA顯著下調HGC-27細胞中PRR11表達，為深入研究PRR11在HGC-27細胞中的作用奠定基礎。我們采用CCK-8試劑盒檢測PRR11-KD細胞與PRR11-NC細胞增殖的差異，結果顯示，PRR11-KD細胞增殖能力受到顯著抑制，提示下調PRR11表達導致HGC-27細胞增殖能力下降。Transwell小室實驗結果顯示，PRR11-KD細胞穿膜數量顯著低于PRR11-NC細胞(P<0.05)，提示PRR11表達下調導致HGC-27細胞侵襲能力下降。為進一步探討上述變化的分子機制，我們采用Western blotting技術檢測了PRR11-KD細胞及PRR11-NC細胞中增殖及侵襲相關蛋白(cyclinD1和MMP-2)表達的狀況，結果顯示，PRR11表達下調導致cyclinD1蛋白及MMP-2蛋白表達降低，提示PRR11表達下調介導的HGC-27細胞侵襲能力下降可能與cyclinD1和MMP-2蛋白表達下降相關。

綜上所述，PRR11表達下調顯著抑制HGC-27細胞的增殖和侵襲能力，其介導的增殖與侵襲能力下降可能與cyclin D1和MMP-2表達下降密切相關，深入研究PRR11的作用機制，有望為解釋胃癌的發生與發展提供理論依據。

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(責任編輯：馬軍)

Knockdown of PRR11 expression inhibits proliferation and invasion in gastric cancer HGC-27 cells

SONG Zongchang, GUO Changsheng, ZHAO Pengfei, TANG Jiahong, HAN Huaizhong, ZHANG Lixin, SHEN Liqun, GUO Chunliang, YUE Rongxi

Department of Oncology, the 155th Central Hospital of PLA/The Key Laboratory for Hematology of Kaifeng, Kaifeng 475003, China

Objective To investigate the influence of PRR11 expression on proliferation and invasion in gastric cancer HGC-27 cells, and to investigate its possible molecular mechanisms.Methods PRR11 shRNA and empty vector lentivirus were transfected into gastric cancer HGC-27 cells, which was divided into two groups. Expression of PRR11 in gastric cancer HGC-27 cells was detected by Western blotting after transfection. Subsequently, cell proliferation and cell invasion were detected by CCK-8 kit and transwell chambers, respectively. Finally, Western blotting was used to study expressions of cyclin D1 and MMP-2 proteins in two gastric cancer cells. Results PRR11 shRNA effectively down-regulated the expression of PRR11 in gastric cancer HGC-27 cells. Additionally, knockdown the expression of PRR11 led to the proliferation inhibition and the decrease of invasion in gastric cancer HGC-27 cells, accompanied by the down-regulation of cyclinD1 and MMP-2 proteins.Conclusion Knockdown of PRR11 expression results in proliferation and invasion inhibition in gastric cancer cells may be closely related to the decrease of expressions of cyclinD1 and MMP-2 proteins.

Gastric cancer; PRR11; Cell proliferation; Cell invasion

河南省開封市科技創新人才項目(1407009)

宋宗昌，博士，主治醫師，研究方向：胃癌診斷與治療。E-mail: szc122@163.com

岳榮喜，碩士，主任醫師，院長，研究方向：消化道腫瘤診斷與治療。E-mail: szc_155@163.com

10.3969/j.issn.1006-5709.2016.11.004

R735.2

A

1006-5709(2016)11-1221-04

2016-08-01