人胃癌組織中NF-κB-p65的表達及臨床意義

李 楊，宋軍民，李曉晗，李 巖

中國醫科大學附屬盛京醫院1. 重癥醫學科; 2. 消化內科; 3. 病理科, 遼寧 沈陽 110004

人胃癌組織中NF-κB-p65的表達及臨床意義

李 楊1，宋軍民2，李曉晗3，李 巖2

中國醫科大學附屬盛京醫院1. 重癥醫學科; 2. 消化內科; 3. 病理科, 遼寧 沈陽 110004

目的 研究人胃癌組織中NF-κB-p65的表達及其對臨床病理特征的影響。方法 應用免疫組織化學方法檢測42例人胃癌石蠟包埋組織、12例癌旁石蠟包埋組織中NF-κB-p65在細胞質和細胞核的表達，分析其在胃癌組織中的表達與臨床病理特征之間的相關性。結果 人胃癌組織中NF-κB-p65在細胞質和細胞核表達均顯著高于癌旁組織(P<0.001)；人胃癌組織中NF-κB-p65在細胞質和細胞核表達呈顯著相關(P<0.001)，與腫瘤分期、浸潤深度、淋巴結轉移、遠處轉移和腫瘤的大小呈顯著相關(P<0.01)。結論 人胃癌組織中NF-κB-p65的表達上調，與胃癌臨床進展密切相關。

胃癌；核因子-Kappa B；NF-κB；p65

胃癌是我國最常見的惡性腫瘤之一，嚴重地影響了人民的健康，據2010年的調查顯示，全國胃癌發病率為30.77/10萬，死亡率為21.89/10萬[1]。NF-κB信號通路參與細胞的增殖、凋亡、血管生成和炎癥反應，對惡性腫瘤的發生、發展、轉移和預后具有重要的作用。研究表明，NF-κB信號通路在胃癌組織中呈過度表達，它調控白介素-2(Bcl-2)、白介素-8(IL-8)、凋亡抑制蛋白(IAPS)家族、環氧合酶-2(COX-2)、人類端粒反轉錄酶(hTERT)等下游基因，參與胃癌的發生、發展、轉移和放化療抵抗等過程[2]。p65是NF-κB最關鍵的組件之一，近年來研究認為，在各種因素的作用下細胞質NF-κB-p65磷酸化后進入細胞核，促進靶基因的轉錄是獨立于抑制性kappa B(inhibitor of κB, IκB)通路的另一條重要途徑[3]。本研究應用免疫組化法探究胃癌組織中NF-κB-p65的表達及其對胃癌臨床病理特征的影響，為胃癌的治療提供潛在的靶點。

1 資料與方法

1.1 一般資料 42例人胃癌石蠟包埋組織來自中國醫科大學附屬盛京醫院2006年1月-2010年1月的胃癌手術患者，男30例，女12例，年齡28～79歲，平均(60.7±12.8)歲；分化程度：未分化和低分化22例，中分化和高分化20例；TNM分期(UICC,2002)：Ⅰ期5例，Ⅱ期9例，Ⅲ期15例，Ⅳ期13例。所有患者術前均未接受化療或放療，均經病理證實為胃腺癌。同時選取這些患者中12例石蠟包埋癌旁組織(距離腫瘤邊界5 cm以上)作為對照組，所有組織切片厚度均為4 μm。

1.2 方法 采用免疫組織化學SP法研究人胃癌和癌旁石蠟包埋組織中的細胞質和細胞核中NF-κB-p65的表達。

1.2.1 所用抗體：細胞質染色應用兔抗人多克隆抗體(購自美國Abcam公司)；細胞核染色應用鼠抗人單克隆抗體(針對p65的細胞核定位序列NLS，購自英國Chemicon公司)。

1.2.2 免疫組織化學SP法染色的步驟：(1)脫蠟；(2)抗原修復；(3)內源性過氧化物酶滅活；(4)加入一抗，細胞質染色濃度為1∶800，細胞核染色濃度為1∶200，4 ℃過夜。(5)加入二抗；(6)DAB染色負染、脫水、透明、樹脂封入、光學顯微鏡下照相。

1.3 結果判定 根據染色陽性細胞數量確定分布評分：無陽性染色細胞，0分；陽性細胞<1/3，1分；陽性細胞1/3～2/3，2分；陽性細胞>2/3，3分；根據陽性細胞染色強度確定程度評分：無染色，0分；中等染色，1分；強染色，2分。染色分布和強度評分相加得到最終染色評分[4]。

2 結果

2.1 人胃癌組織和癌旁組織中細胞質NF-κB-p65的表達 在人胃癌癌旁組織中細胞質NF-κB-p65蛋白呈中等表達(見圖1A)；在人胃癌組織中細胞質NF-κB-p65蛋白呈強表達，陽性染色為棕黃色，染色評分為(3.2±1.1) 分(見圖1B、1C)；人胃癌組織中細胞質NF-κB-p65的表達顯著高于癌旁組織(P<0.001)。

2.2 人胃癌組織和癌旁組織中細胞核NF-κB-p65的表達 在人胃癌癌旁組織中細胞核NF-κB-p65蛋白呈極弱表達(見圖1D)，在人胃癌組織中細胞核NF-κB-p65蛋白呈較強表達，陽性染色為土黃色，染色評分為(2.7±0.8) 分，此外細胞質中也有部分表達(見圖1E、1F)；人胃癌組織中細胞核NF-κB-p65的表達顯著高于癌旁組織(P<0.001)。

圖1 人胃癌組織和癌旁組織中細胞質和細胞核NF-κB-p65的表達(200×) A: 癌旁組織中細胞質NF-κB-p65的表達; B: 胃癌組織中細胞質NF-κB-p65的表達(高分化); C: 胃癌組織中細胞質NF-κB-p65的表達(低分化); D: 癌旁組織中細胞核NF-κB-p65的表達; E: 胃癌組織中細胞核NF-κB-p65的表達(高分化); F: 胃癌組織中細胞核NF-κB-p65的表達(低分化)

Fig 1 Expression of cytoplasmic and nuclear NF-κB-p65 in adjacent non-tumor and gastric cancer tissue samples (200×) A: cytoplasmic NF-κB-p65 expression in adjacent non-tumor tissue samples; B: cytoplasmic NF-κB-p65 expression in high-differentiated gastric cancer tissue samples; C: cytoplasmic NF-κB-p65 expression in poorly-differentiated gastric cancer tissue samples; D: nuclear NF-κB-p65 expression in adjacent non-tumor tissue samples; E: nuclear NF-κB-p65 expression in high-differentiated gastric cancer tissue samples; F: nuclear NF-κB-p65 expression in poorly-differentiated gastric cancer tissue samples

2.3 人胃癌組織細胞質和細胞核中NF-κB-p65的表達與臨床病理特征之間的相關性分析 Spearman秩相關檢驗提示，人胃癌組織細胞質和細胞核中NF-κB-p65的表達呈顯著相關(P<0.001)；人胃癌組織細胞質中NF-κB-p65的表達與腫瘤TNM分期、浸潤深度、淋巴結轉移、遠處轉移和腫瘤的大小呈顯著相關(P<0.01)，人胃癌組織細胞核中NF-κB-p65的表達與腫瘤TNM分期、浸潤深度、淋巴結轉移、遠處轉移和腫瘤的大小呈顯著相關(P<0.01)，而與年齡、性別和腫瘤分化程度均無相關性(P>0.05, 見表1)。

表1 人胃癌組織中NF-κB-p65的表達與臨床病理參數之間的相關性分析

Tab 1 The relationship between expression of NF-κB-p65 and clinical pathological paxrameters of gastiric cancer tissues

例數細胞質中NF?κB?p65表達(x±s)P值細胞核中NF?κB?p65表達(x±s)P值年齡(歲)>0．05>0．05 <60153．2±1．12．5±0．8 ≥60273．1±1．12．7±1．2性別>0．05>0．05 男303．1±1．12．7±0．5 女123．4±1．02．7±0．7TNM分期<0．01 Ⅰ52．2±0．42．2±0．4<0．001 Ⅱ92．8±1．02．1±0．3 Ⅲ153．1±1．12．9±0．7 Ⅳ133．8±1．13．0±0．4浸潤深度<0．001<0．001 T162．7±0．72．3±0．5 T242．3±0．52．0±0．0 T3243．0±1．02．6±0．5 T484．4±0．73．4±0．7區域淋巴結轉移<0．01<0．001 N0142．6±0．92．1±0．4 N1283．5±1．12．8±0．6遠處轉移<0．01<0．01 M0292．9±1．02．5±0．7 M1133．8±1．13．0±0．4腫瘤大小(cm)<0．01<0．01 <5262．8±0．92．4±0．5 ≥5163．8±1．23．1±0．7分化程度>0．05>0．05 中-高分化203．1±1．22．8±0．8 低-未分化223．1±1．02．6±0．5

3 討論

本研究中，我們發現與癌旁組織相比人胃癌組織細胞質和細胞核中NF-κB-p65表達均顯著升高，提示NF-κB-p65表達上調參與胃癌的發生過程。以往的研究表明，作為胃癌的I類致病原，幽門螺桿菌(Helicobacter pylori,H.pylori)感染能激活胃上皮細胞的NF-κB信號通路，從而參與胃癌的發生和發展[5-6]。進一步的研究表明，H.pylori能增加NF-κB-p65的核染色和轉錄活性[7-8]，提示NF-κB-p65的表達上調和核移位在胃癌的發生和發展中發揮重要作用。此外，我們以前的研究提示，單核細胞趨化蛋白-1(monocyte chemoattractant protein-1, MCP-1)不但能顯著誘導人胃癌細胞NF-κB-p65 的表達上調，而且能促進其核移位[9]。另有研究表明，H.pylori感染能誘導胃上皮細胞中的MCP-1表達[10]。因此，MCP-1可能是H.pylori誘導NF-κB-p65表達上調的重要機制之一。

NF-κB-p65在靜息狀態下位于腫瘤細胞的細胞質，在H.pylori和MCP-1等各種因素的作用下，NF-κB-p65發生磷酸化后進入細胞核(核移位)，具有DNA轉錄活性，與眾多基因的啟動子結合，促進其轉錄，對腫瘤的發生、發展、轉移和預后產生顯著影響。我們的研究表明，細胞質與細胞核中NF-κB-p65表達均與胃癌的腫瘤分期、浸潤深度、淋巴結轉移、遠處轉移、腫瘤的大小呈顯著相關，提示NF-κB-p65參與胃癌的臨床進展。以往的研究表明，細胞質和細胞核中NF-κB-p65能促進NF-κB信號通路的靶基因表達上調，降低胰腺癌的2年生存率，對腫瘤的預后產生不利的影響[11]。同時，NF-κB-p65的磷酸化能促進DNA甲基轉移酶-1募集到染色體上，抑制乳腺癌轉移抑制物1(breast cancer metastasis suppressor 1, BRMS1)基因的表達，BRMS1是重要的乳腺癌抑癌基因之一[12]；而且，NF-κB-p65的磷酸化還是結直腸癌的獨立預后因素[13]。此外，細胞核NF-κB-p65是原發性前列腺癌盆腔淋巴結轉移的高度預測指標[14]。這些研究提示NF-κB-p65促進腫瘤的轉移，影響腫瘤的預后，與我們的研究相符。此外，當應用siRNA技術對NF-κB-p65進行沉默后，食管鱗癌細胞的無嘌呤無嘧啶核酸內切酶(Apurinic/apyrimidinic endonuclease-1, APE-1)表達水平顯著下降，腫瘤凋亡指數顯著增加，由于APE-1是引起腫瘤細胞耐藥的關鍵酶之一，NF-κB-p65可能還參與腫瘤的耐藥和凋亡機制[15]。因此，抑制NF-κB-p65的表達和核移位可能對胃癌細胞的耐藥產生顯著的抑制作用。將來的研究需進一步闡明NF-κB-p65與DNA的結合位點、調控基因以及具體作用機制。

總之，我們的研究表明，人胃癌組織中NF-κB-p65表達上調，它與腫瘤分期、浸潤深度、淋巴結轉移、遠處轉移和腫瘤的大小顯著相關，提示其參與胃癌的臨床進展，因此，NF-κB-p65可能成為胃癌治療的靶點之一，抑制NF-κB-p65的表達和磷酸化(核移位)將可能對胃癌的臨床進展產生顯著的抑制作用。

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(責任編輯：李 健)

Clinical significance of NF-κB-p65 expression in human gastric cancer tissue

LI Yang1, SONG Junmin2, LI Xiaohan3, LI Yan2

1. Department of Intensive Care Unit; 2. Department of Gastroenterology; 3. Department of Pathology, Shengjing Hospital of China Medical University, Shenyang 110004, China

Objective To clarify the expression of NF-κB-p65 and its effects on clinicopathological features in human gastric cancer tissue.Methods Immunohistochemical staining was used to examine the expression of NF-κB-p65 in cytoplasm and nuclear in 42 human gastric cancer tissue samples and 12 adjacent non-tumor samples, and the correlation between expression of NF-κB-p65 in cytoplasm and nuclear in gastric cancer tissue samples and clinicopathological features was assessed respectively.Results The expression of NF-κB-p65 in cytoplasm and nuclear was significantly upregulated in gastric cancer tissue samples compared with adjacent non-tumor tissue samples (P<0.001); in gastric cancer tissue samples, expression of NF-κB-p65 in cytoplasm was correlated with expression of NF-κB-p65 in nuclear significantly (P<0.001), and they were significantly correlated with stage, penetration depth, lymph node metastasis, distant metastasis and the size of tumor (P<0.01).Conclusion NF-κB-p65 is upregulated in human gastric cancer tissue, and it is closely related to the clinical progression of gastric cancer.

Gastric cancer; Nuclear factor-Kappa B; NF-κB; p65

李楊，講師，博士研究生，研究方向：消化道腫瘤的基礎和臨床。E-mail: liyangdoctor@sina.com

李巖，教授，博士生導師，研究方向：消化道腫瘤的基礎和臨床。E-mail：yanli0227@126.com

10.3969/j.issn.1006-5709.2016.11.005

R735.2

A

1006-5709(2016)11-1225-04

2015-03-02