小麥赤霉病菌代謝物 Integracide A抗菌除草活性研究

李婉婉，魏少鵬，姬志勤

(西北農林科技大學 植物保護學院，陜西楊凌　712100)

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小麥赤霉病菌代謝物 Integracide A抗菌除草活性研究

李婉婉，魏少鵬，姬志勤

(西北農林科技大學 植物保護學院，陜西楊凌712100)

摘要為明確小麥赤霉病菌(Fusarium graminearum)農藥活性代謝物的結構及其抗菌除草活性。采用乙酸乙酯提取、凝膠柱層析及反相高效液相色譜分離技術獲得該代謝物高純度活性化合物，采用核磁共振波譜和多級質譜等技術鑒定其化學結構；采用菌絲生長速率法、微量稀釋法和平皿法測定該代謝物的抗真菌、抗細菌和除草活性。結果表明：活性化合物鑒定為四環三萜類抗生素-integracide A，其對煙草青枯病菌(Pseudomonas solanacearum)有強烈的抑菌活性，最低抑菌質量濃度(MIC)為6.25 mg/L；對反枝莧(Amaranthus retroflexus)種子萌發和根生長有強烈的抑制作用，抑制中濃度(EC50)分別為13.20 mg/L和3.46 mg/L。小麥赤霉病菌代謝物integracide A具有較強的抑菌和除草活性。

關鍵詞小麥赤霉病菌；Integracide A；抑菌活性；除草活性

小麥赤霉病是溫暖潮濕麥區廣泛發生的一種毀滅性病害[1-2]，赤霉病的發生不僅導致小麥嚴重減產，而且病菌產生的毒素可影響人畜的健康安全[3]。近年來，小麥赤霉病的發生面積約占全國小麥種植總面積的1/4，該病是中國小麥最嚴重的病害之一[4-5]。目前，對小麥赤霉病的防治主要是在揚花期噴灑多菌靈等苯并咪唑類殺菌劑進行化學防治[6-7]。近幾年，國內對小麥赤霉病菌代謝物的研究主要集中在毒素方面，劉新瓊[8]研究發現小麥赤霉病粗毒素對小麥胚根生長有一定的影響。國內對小麥赤霉病菌代謝物以及其作用的研究較少，而國外在該方面的研究相對較多，主要集中在醫學方面。1996年Bill等[9]對小麥赤霉病菌代謝物分離發現一種代謝物有抗HIV的作用，同時，對反枝莧(Amaranthusretroflexus)有較強的種子萌發和根生長抑制作用。為尋找小麥霉病菌農藥活性成分，本試驗對其次級代謝產物進行提取、分離、結構鑒定及農藥活性評價。

1材料與方法

1.1材 料

1.1.1供試菌株發酵菌株：小麥赤霉病菌(Fusariumgraminearum)由西北農林科技大學植物病理研究室提供，農藥研究所保藏(保藏號：NYS-XC)。

病原真菌菌株：茄子黃萎病菌(Verticilliumdahliae，NYS-QH)、玉米彎孢病菌(Curvularialunata，NYS-YW)、煙草赤星病菌(Alternariaalternata，NYS-YC)、蘋果炭疽病菌(Colletotrichumgloesporioides，NYS-PT)、西瓜枯萎病菌(Fusariumoxysporum，NYS-XK)、番茄灰霉病菌(Botrytiscinerea，NYS-FH)、油菜菌核病菌(Sclerotiniasclerotiorum，NYS-YJ)，以上植物病原真菌由西北農林科技大學植物病理研究室提供，農藥研究所保藏。將病原真菌接種于PDA培養基，于25 ℃下培養3～7 d。

病原細菌菌株：煙草青枯病菌(Pseudomonassolanacearum，NYS-YQ)、獼猴桃潰瘍病菌(Pseudomonassyringaepv.actinidiae，NYS-MK)由西北農林科技大學農藥研究所提供、保藏。枯草芽孢桿菌(Bacillussubtilis，CGMCC 1.88)、蠟狀芽孢桿菌(Bacilluscereus，CGMCC 1.1846)、銅綠假單胞菌(Pseudomonasaeruginosa，CGMCC 1.2031)、金黃色葡萄球菌(Staphyloccocusaureus，CGMCC 1.189)、大腸埃希氏菌(Escherichiacoli，CGMCC 1.1574)，購自中國普通微生物菌種保藏管理中心。將病原細菌接種于牛肉膏蛋白胨瓊脂培養基，于37 ℃下培養1 d。

1.1.2供試植物小麥(Triticumaestivum)、稗草(Echinochloacrusgalli)、油菜(Brassicanapus)和反枝莧(Amaranthusretroflexus)，由西北農林科技大學農藥研究所提供、保藏。

1.1.3試劑和儀器ZHWY-C2112F恒溫搖床，上海智誠分析儀器制造有限公司；Bruker DRX 500核磁共振儀(氘代試劑為DMSO)，德國布魯克公司；WPR熔點儀，上海精科公司；高效液相色譜儀(LC6000)，具UV檢測器(LC3000)，北京創新通恒科技有限公司；Finnegan LCQ Advantage MAX高效液相色譜-質譜聯用儀，配有ESI電離源和離子阱質量分析器(HPLC-ESI-MS/MS)，美國熱電公司；乙醇、乙酸乙酯等均為市售分析純產品。對照藥劑、氨芐青霉素鈉(USP級)購自上海國藥集團化學試劑有限公司。

1.2試驗方法

1.2.1活性成分提取、分離及結構鑒定10 L發酵液用雙層紗布過濾，取菌絲體，置陰涼處通風晾干，得35 g菌絲體；將菌絲體用剪刀剪碎后置入250 mL圓底燒瓶，加入100 mL乙酸乙酯回流提取3次，每次3 h，合并提取液，減壓濃縮得1.8 g濃縮物。濃縮物用5 mL甲醇溶解，經凝膠柱層析(Sephadex LH-20，瑞典Amersham Biosciences公司)和反相高效液相色譜(色譜條件：Hypersil ODS2 C18 30 mm×300 mm，10 μm；流動相V(甲醇)∶V(水)=80∶20；流速15.0 mL/min)純化，得0.97 g活性化合物CM01。采用核磁共振譜及多級質譜技術對其進行結構鑒定。1.2.2抑菌活性評價參照《農藥室內生物測定試驗準則》中的抑制菌絲生長法評價化合物對供試真菌的抑菌活性[10]。參照美國國家臨床實驗室標準委員會的微量稀釋法測定化合物對供試病原細菌的抑菌活性[11]。

1.2.3除草活性評價采用平皿法測定化合物對供試作物的除草活性[10-11]。

2結果與分析

2.1小麥赤霉病菌代謝物活性成分分離及結構鑒定

根據1H和13C NMR及ESI-MS，并結合相關文獻[12-13]，將化合物CM01鑒定為integracide A(圖1)，具體理化數據如下。

圖1　Integracide A的化學結構

Integracide A，黃色片狀結晶。熔點：176.3～177.5 ℃；UV(甲醇) λmax：248 nm。1H NMR(DMSO-d6, 500MHz) δ 5.51(brs, 1H), 5.39(d,J=5.5 Hz, 1H), 5.31(s, 1H), 4.97(s, 1H), 4.71(s, 1H), 4.66(s, 1H), 4.09(m, 1H), 3.78(dt,J=11.0, 4.0Hz, 1H), 3.59(d, J=10.0 Hz, 1H), 2.26～2.50(m, 3H), 2.18～2.23(m, 2H), 2.04～2.11(m, 2H), 1.97(s, 3H), 1.84～1.91(m, 2H), 1.67～1.71(m, 1H), 1.51～1.64(m, 3H), 1.20(s, 3H), 1.06～1.13(m, 3H), 0.97～1.00(m, 12H), 0.85(d,J=6.0 Hz, 3H), 0.77(s, 3H);13C NMR(DMSO-d6, 125MHz) δ 170.3, 156.2, 147.5, 139.9, 124.2, 120.6, 107.0, 88.5, 78.2, 67.9, 67.3, 50.7, 49.0, 46.9, 43.8, 40.5, 37.7, 35.3, 34.4, 33.6, 33.2, 30.9, 29.1, 26.6, 23.1, 22.3, 22.1, 21.4, 18.3, 18.2, 17.9, 17.0;ESI-MS(負離子模式):m/z593 [M-H]-;ESI-MS/MS(%):m/z533(100), 503(20), 435(10), 421(75), 407(35), 393(25)(圖2)，可能的裂解途徑如圖3所示。

2.2小麥赤霉病菌代謝物抑菌活性

抑制真菌菌絲生長活性結果表明(表1)，在供試質量濃度(50 mg/L)下，integracide A對茄子黃萎病菌、玉米彎孢病菌、煙草赤星病菌和蘋果炭疽病菌有明顯的抑制作用，其菌絲生長抑制率分別為78.1%，66.4%，52.5%和67.2%。毒力測定結果表明(表2)，integracide A對茄子黃萎病菌、玉米彎孢病菌、煙草赤星病菌和蘋果炭疽病菌菌絲生長的最低抑菌質量濃度值(MIC)分別為34.90、37.77、51.64和39.08 mg/L。

圖2　Integracide A的電噴霧質譜圖(負離子模式)

圖3　 Integracide A電噴霧質裂解途徑

抑制細菌活性結果表明(表3)，integracide A對煙草青枯病菌、枯草芽孢桿菌、蠟狀芽孢桿菌、金黃色葡萄球菌有較強的抑菌活性，其MIC值分別為6.25、12.5、6.25和12.5 mg/L。化合物integracide A對獼猴桃潰瘍病菌、銅綠假單胞菌和大腸埃希氏菌沒有明顯的抑制作用。

表1　 Integracide A對供試病原真菌菌絲生長的抑制作用

表2　Integracide A對供試病原真菌菌絲生長的毒力

注：x為濃度對數；y為抑制率的機率值，表4同。

Note：xis logarithm of concentration;yis the problit value of inhibition.The same as table 4.

表3　 Integracide A對供試病原細菌的最低抑菌質量濃度

2.3小麥赤霉病菌代謝物除草活性

分別以小麥和稗草為單子葉植物代表，油菜和反枝莧為雙子葉植物代表，采用平皿法測定integracide A的除草活性。結果表明，integracide A在100 mg/L質量濃度下對小麥、稗草和油菜種子萌發及根生長無明顯的抑制作用，但對反枝莧種子萌發及根生長有強烈的抑制作用。毒力測定結果表明(表4)，integracide A對反枝莧種子萌發的抑制中濃度(EC50)為13.20 mg/L，對根生長的EC50為3.46 mg/L。

表4　Integracide A對反枝莧的除草活性

3討 論

Integracide A是Brill等[9]1996年從土壤微生物鐮刀菌(Fusariumcompactumsp.)中分離獲得。目前，關于integracide A及其類似物的生物活性主要集中在抗HIV方面，農藥活性方面的研究報道較少[12-17]。Brill等[9]測定integracide A對動物致病真菌的抑菌活性，在100 mg/L質量濃度下，integracide A對白色念珠菌(Candidalbicans)、光滑球擬酵母菌(Torulopsisglabrata)、白色隱球菌(Cryptococcusalbidus)和黑曲霉(Aspergillusniger)等病原真菌無明顯的抑菌活性，對革蘭氏陰性細菌亦沒有明顯抑菌活性，僅對革蘭氏陽性細菌如金黃色葡萄球菌(S.aureus)和鏈球菌(Streptococcus)有抑菌活性。本研究結果表明，integracide A對供試的8種農業病原真菌有一定的抑菌活性，其中對茄子黃萎病菌、玉米彎孢病菌、煙草赤星病菌和蘋果炭疽病菌較好，其菌絲生長的EC50分別為34.90、37.77、51.64和39.08 mg/L。細菌活性測定結果與文獻報道的基本一致，但化合物integracide A除對革蘭氏陽性菌有抑菌活性外，本研究發現，其對重要的農業病原細菌煙草青枯病菌(革蘭氏陰性菌)亦有明顯的抑菌活性，其MIC為6.25 mg/L。除草活性測定結果表明，integracide A在100 mg/L質量濃度下對小麥、稗草和油菜無明顯的種子萌發和根生長抑制作用，但對重要的田間雜草反枝莧有強烈的種子萌發和根生長抑制作用，其對種子萌發的EC50為13.20 mg/L，對根生長的EC50僅為3.46 mg/L。

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Received 2015-03-11Returned2015-04-24

Foundation itemNational Natural Science Foundation of China(No.31371973,No.31301700);National Natural Science Foudation of Shaanxi Province(No.2013JQ3003);Fundamental Research Funds for the Central Universities(QN2013009).

First authorLI Wanwan, female,master student.Research area:chemistry of natural product.E-mail:liwanwan@nwsuaf.edu.cn

(責任編輯：史亞歌Responsible editor:SHI Yage)

Antimicrobial and Herbicidal Activities of Integracide A,a Metabolite Produced byFusariumgraminearum

LI Wanwan, WEI Shaopeng and JI Zhiqin

(College of Plant Protection, Northwest A&F University, Yangling Shaanxi712100, China)

AbstractTo understand the structure, antimicrobial and herbicidal activities of metabolite from Fusarium graminearum.The metabolite was obtained by ethyl acetate extract, gel column chromatography and reverse phase high performance liquid chromatography(RP-HPLC), and was identified based on spectral data of NMR and ESI-MS/MS.Antimicrobial activities of the compound were evaluated by inhibition of mycelial growth and micro dilution methods, respectively.Herbicidal activities were tested by plating method.The metabolite was identified as integracide A, a member of tetracyclic triterpenoid family.Integracide A showed strong antibacterial activity against Pseudomonas solanacearum, and the MIC value was 6.25 mg/L.It also exerted herbicidal activity against Amaranthus retroflexus, and the EC50were 13.20 mg/L and 3.46 mg/L against the seed germination and root growth, respectively.Integracide A was isolated from the metabolite of F.graminearum and showed a strong antibacterial and herbicidal activity.

Key wordsFusarium graminearum;Integracide A;Antimicrobial activity;Herbicidal activity

Corresponding authorJI Zhiqin, male,Ph.D,associate research fellow.Research area:chemistry of natural product.E-mail:jizhiqin@nwsuaf.edu.cn

中圖分類號S481+.9

文獻標志碼A

文章編號1004-1389(2016)03-0465-06

通信作者：姬志勤，男，副研究員，研究方向為天然產物化學。E-mail：jizhiqin@nwsuaf.edu.cn

基金項目：國家自然科學基金(31371973，31301700)；陜西省自然科學基金(2013JQ3003)；中央高校基本科研業務費(QN2013009)。

收稿日期：2015-03-11修回日期：2015-04-24

網絡出版日期：2016-03-06

網絡出版地址：http://www.cnki.net/kcms/detail/61.1220.S.20160306.1611.040.html

第一作者：李婉婉，女，碩士研究生，研究方向為天然產物化學。E-mail：liwanwan@nwsuaf.edu.cn