PEG介導的蘋果果生刺盤孢Colletotrichumfructicola原生質體轉化

韓小路，白靜科，張 　瑋，張　榮，孫廣宇

(西北農林科技大學 植物保護學院,陜西楊凌　712100)

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PEG介導的蘋果果生刺盤孢Colletotrichumfructicola原生質體轉化

韓小路，白靜科，張 瑋，張榮，孫廣宇

(西北農林科技大學 植物保護學院,陜西楊凌712100)

摘要為建立PEG介導的蘋果果生刺盤孢Colletotrichum fructicola的遺傳轉化體系，以果生刺盤孢SQ06-E的幼嫩菌絲為受體，通過PEG介導的原生質體轉化法，將含有潮霉素標記的質粒pCB1003轉入果生刺盤孢菌絲的原生質體中；對獲得的轉化子進行遺傳穩定性檢測、PCR檢測和Southern雜交分析。試驗獲得果生刺盤孢的最優轉化體系為：密度為1×106 mL-1分生孢子在M3S培養基中，28 ℃、200 r/min震蕩培養8 h；過濾收集菌絲，在質量濃度為0.25 g/mL崩潰酶+0.05 g/mL溶壁酶的10 mL酶解液中加入0.5 g濕菌體酶解3 h；整個試驗的滲透壓穩定劑為0.8 mol/L KCl。試驗共得到76個轉化子，轉化率為1 μg DNA獲得3～4個轉化子。對轉化子的PCR檢測和Southern雜交分析都表明hph基因已整合入果生刺盤孢的基因組中。所有轉化子在PDA培養基上繼代5次后仍能正常生長，說明外源基因hph能在果生刺盤孢中穩定遺傳。

關鍵詞蘋果炭疽葉枯病；遺傳轉化；轉化子鑒定

蘋果炭疽病是由刺盤孢屬(ColletotrichumCda.)的真菌引起的一類重要病害，包含果實上的苦腐病(Bitter rot of apple)和葉片上的葉枯病(Glomerellaleaf spot)[1]。苦腐病主要引起大量落果、果實腐爛、降低果品的產量和質量，并可能危害后期的貯藏和運銷。葉枯病是一種流行性很強的病害，一旦發生，造成早期大量落葉，樹勢變弱，枝條二次開花和發芽，對蘋果產業威脅很大[2-3]。隨著分子生物學技術在分類學中的應用，特別是“系譜一致性系統發育種識別(Genealogical Concordance Phylogenetic Species Recognition，GCPSR)”理論[4]的提出，使許多復合種得以澄清，刺盤孢屬的分類有很大變化，以前被認為是蘋果炭疽病病原菌的真菌分類地位有很大變動[5-7]。引起中國蘋果炭疽葉枯病的病原被鑒定為果生刺盤孢(C.fructicola)和隱秘刺盤孢(C.aenigma)，其中果生刺盤孢為優勢種[8]。

目前，刺盤孢屬已有6個種完成基因組測序，故對刺盤孢的研究已經進入后基因組時代[9-12]。因此，建立方便、高效的遺傳轉化體系對進一步研究刺盤孢的功能基因組學和致病機制有重要意義。PEG介導的原生質體轉化方法是使用較早的細胞融合方法，由Kao等[13]建立。PEG介導的原生質體轉化在絲狀真菌中應用廣泛，如在稻瘟菌[14]、禾谷鐮刀菌[15-16]等病原真菌中進行信號轉導、生長發育、致病等相關基因敲除突變體的研究取得許多重要進展。Rodriguez等[17]首次使用PEG介導的原生質體轉化方法將amdS+和hygBR基因成功轉入豆刺盤孢(Colletotrichumlindemuthianum)中，開啟刺盤孢的轉化研究。目前，已報道的利用PEG介導轉化的刺盤孢有膠孢刺盤孢(C.gloeosporioides)[18]、瓜類刺盤孢(C.lagenarium)[19-21]和三葉草刺盤孢(C.trifolii)[22-23]等。但是研究[20,23]發現，不同刺盤孢的原生質體制備條件和轉化條件都存在差異。

建立方便、穩定、高效的蘋果果生刺盤孢遺傳轉化體系是研究基因功能的前提，而在眾多轉化方法中，PEG介導的原生質體轉化方法在基因定點敲除上有很大優勢。在該方法中能否制備大量完整的原生質體是轉化成功與否的關鍵。目前，有關蘋果果生刺盤孢原生質體制備及PEG介導的遺傳轉化研究尚未見報道。因此，本研究建立PEG介導的蘋果果生刺盤孢原生質體轉化體系，為進一步研究果生刺盤孢功能基因組學和致病機制奠定基礎。

1材料與方法

1.1試驗材料

1.1.1供試菌株和質粒蘋果果生刺盤孢SQ06-E為西北農林科技大學植物保護學院真菌研究室于2012年從河南商丘的蘋果葉片上分離純化得到；攜帶潮霉素磷酸轉移酶基因(hph)的質粒pCB1003由西北農林科技大學許金榮教授惠贈。

1.1.2供試引物、培養基和試劑檢測潮霉素抗性基因的引物序列為H852：5′-AACTCACCGCGACGTCTGTC-3′，H850：5′-TTGTCCGTCAGGACATTGTT-3′[24]，由上海生工生物有限公司合成。

CMC培養基：羧甲基纖維素鈉15 g，NaNO31 g，KH2PO41 g，MgSO4·7H2O0.5 g，酵母膏1 g，加水定容至1 000 mL[25]。

M3S培養基：MgSO4·7H2O 2.5 g，KH2PO42.7 g，蛋白胨1 g，酵母膏1 g，蔗糖10 g，加水定容至1 000 mL[26]。

TB3培養基：酵母膏3 g，酸水解酪蛋白3 g，蔗糖200 g，加水定容至1 000 mL[27]。

Top Ager：酵母膏3 g，酸水解酪蛋白3 g，蔗糖200 g，瓊脂15 g，加水定容至1 000 mL[27]。

Bottom Ager：酵母膏3 g，酸水解酪蛋白3 g，蔗糖200 g，瓊脂10 g，加水定容至1 000 mL[27]。

STC溶液：蔗糖200 g，0.5 mol/L Tris-HCl 100 mL，KCl 7.351 g，加水定容至1 000 mL[27]。

PTC：40 g PEG 8000 ，用STC定容至100 mL，加熱溶解，4 ℃保存[27]。

潮霉素B和DIG High Prime DNA Labeling and Detection Starter Kit I購自德國Roche公司。MiraCloth購自美國Calbiochem公司。崩潰酶(Driselase)和溶壁酶(Lysing Enzymes)購自美國Sigma公司。其他常規分子生物學試劑均購自TaKaRa公司。

1.2潮霉素質量濃度與供試蘋果炭疽菌的關系

配制潮霉素B質量濃度梯度(0、30、60、90和100 mg/L)的PDA平板，在活化好的果生刺盤孢菌落邊緣打取菌餅(d=6 mm)，接種在平板中央，25 ℃培養5 d后觀察菌落生長情況。每個處理3個重復。

1.3果生刺盤孢分生孢子誘導及萌發

1.3.1果生刺盤孢分生孢子的誘導將果生刺盤孢SQ06-E接種于PDA平板上活化培養7 d，挑取3塊2 cm2的菌餅接種到裝有100 mL CMC培養基的250 mL三角瓶中，25 ℃、180 r/min震蕩培養72 h，誘導產孢。

1.3.2分生孢子數與分生孢子萌發的關系震蕩培養72 h后，用1層MiraCloth過濾，收集液體，3 500 r/min離心10 min，棄上清。用無菌水沖洗孢子2遍，再用無菌水將孢子配成一定密度的懸液，加入到100 mL M3S培養基中，培養基中孢子終密度分別為1×103、1×104、1×105、1×106和1×107mL-1，28 ℃、250 r/min震蕩培養8 h后計孢子萌發率并測量菌絲長度。每個密度3個重復。

1.4果生刺盤孢原生質體制備的影響因素

將分生孢子懸液配成最適密度，加入到裝有100 mL M3S培養基的250 mL三角瓶中，28 ℃、250 r/min震蕩培養8 h，用1層MiraCloth過濾培養基并收集菌絲，再用0.8 mol/L KCl沖洗2次，將菌絲分裝于50 mL離心管中，每管0.5 g，加入10 mL酶解液，在搖床上31 ℃、80 r/min振蕩酶解3 h。用3層擦鏡紙和1層MiraCloth過濾酶解混合物到50 mL離心管中，室溫、3 500 r/min離心10 min，收集原生質體，用STC溶液沖洗原生質體后懸浮，血球計數板計數，每次試驗設3個重復，每個重復計數3次，計算平均值。

1.4.1菌齡供試菌株分生孢子培養時間分別為8、10、12和14 h，其他操作同“1.4”。

1.4.2酶質量濃度分別用質量濃度為1.5、2.0、2.5和3 g/mL的崩潰酶與0.05 g/mL的溶壁酶配成酶解液處理菌絲，其他操作同“1.4”。

1.4.3酶解時間菌絲于酶解液中的酶解時間分別為2.0、2.5、3.0和3.5 h，其他操作同“1.4”。

1.4.4滲透壓穩定劑濃度滲透壓穩定劑分別是濃度為0.7、0.8、1、1.2和1.4 mol/L的 KCl溶液，沖洗菌絲和配制酶解液的滲透壓穩定劑濃度保持一致，其他操作同“1.4”。

1.5果生刺盤孢原生質體的轉化

將制備好的原生質體用STC重新懸浮到2～5×107mL-1。加入10～20 ng的DNA片段到含有200 μL原生質體懸浮液的50 mL離心管中，輕輕混合均勻后室溫靜置20 min。緩慢加入1 mLw=40%的PTC(用細菌過濾器過濾)到管中輕輕混勻，靜置20 min。加入TB3，25 ℃、80 r/min搖床中過夜。3 500 r/min離心10 min，棄上清，余下1 mL殘夜將剩余物懸浮。加入10～15 mL Bottom Ager(含抗生素和潮霉素B)，混勻后倒板，室溫培養10 h。用10 mL Top Ager覆蓋于平板上，25 ℃下培養2～3 d，挑取轉化子。

1.6果生刺盤孢轉化子的鑒定

1.6.1轉化子遺傳穩定性檢測挑取果生刺盤孢轉化子接種于含潮霉素的PDA平板上，繼代培養5次，觀察轉化子對潮霉素抗性的情況。

1.6.2轉化子的PCR檢測用CTAB法提取果生刺盤孢轉化子和野生型菌株SQ06-E的基因組DNA，以潮霉素磷酸轉移酶特異性引物H852和H850進行PCR擴增，檢測hph基因的插入和整合情況。PCR反應條件為：94 ℃預變性3 min；94 ℃變性20 s，60 ℃退火1 min，72 ℃延伸70 s，循環37次；72 ℃延伸10 min。PCR產物用10 g/L的瓊脂糖凝膠電泳檢測。

1.6.3轉化子的Southern blot分析基因組DNA使用BioFlux的真菌基因組提取試劑盒提取，PstⅠ單酶切后進行瓊脂糖凝膠電泳分析。以hph的PCR產物為模板，探針標記和檢測方法按照試劑盒(DIG High Prime DNA Labeling and Detection Starter KitⅠ)說明書進行，檢測轉化子基因組中hph基因的插入拷貝數。

2結果與分析

2.1潮霉素對供試果生刺盤孢的影響

將果生刺盤孢接種于含有不同質量濃度潮霉素B的PDA平板上，培養5 d后觀察果生刺盤孢的生長情況。結果表明，當潮霉素質量濃度為30 mg/L時，SQ06-E菌株就已經停止生長，由于潮霉素有見光分解的特性，考慮培養時間較長，故選擇50 mg/L潮霉素B進行陽性轉化子的篩選。

2.2分生孢子密度對分生孢子萌發的影響

將分生孢子懸液配成1×103、1×104、1×105、1×106和1×107mL-1的密度，于250 mL三角瓶中振蕩培養8 h，孢子萌發率及萌發后菌絲的長度如圖1所示。結果表明，當孢子密度為1×103、1×104和1×105mL-1時，孢子萌發率均為100%，而當孢子密度為1×106和1×107mL-1時，孢子萌發率降至60%和11%。同時，當孢子密度為1×103、1×104和1×105mL-1時，孢子萌發長出的菌絲長度約為890 μm，而當孢子密度為1×106和1×107mL-1時，菌絲長度明顯變短為380和240 μm(圖1)。由此可知，當分生孢子密度過高時，孢子的萌發和菌絲的生長都存在一定地自抑作用，而孢子密度過低又收集不到大量幼嫩菌絲，當分生孢子懸液密度為1×106mL-1時，孢子的萌發率、菌絲量和菌絲長度最適宜。

柱上不同小寫字母表示差異顯著(P<0.05)。下同

Different letters in column indicate significant difference atP<0.05.The same below.

圖1孢子密度與孢子萌發率和菌絲長的關系

Fig.1Relationship between spore density and spore

germination rate and hyphae length

2.3原生質體制備條件優化

2.3.1菌 齡當分生孢子震蕩培養到8～14 h時，每2 h取樣1次，酶解試驗所用菌絲菌齡分別為搖培8、10、12和14 h 4個對照。當果生刺盤孢的搖培時間為8 h時，獲得的原生質體數量最多，可達3.64×106mL-1(圖2)。分生孢子搖培時間過短，菌絲生長較短，收集不到大量的幼嫩菌絲；而搖培時間過長，菌絲的細胞壁生長過厚，不易酶解。故搖培時間過短或過長，原生質體的產量均有所下降。因此，選擇分生孢子在25 ℃、200 r/min搖培8 h后酶解，獲得的原生質體最多。

2.3.2酶質量濃度分別用質量濃度為1.5 、2、2.5和3 g/mL的崩潰酶與0.05 g/mL的溶壁酶混合配成酶解液處理菌絲。當崩潰酶的質量濃度為2.5 g/mL時，獲得的原生質體數量最多，可達3.24×106mL-1(圖3)。酶質量濃度過低時，得不到足夠量的原生質體。而酶質量濃度過高時，過量的酶會繼續降解原生質體，導致原生質體量減少，同時還會影響原生質體的再生。

圖2　孢子培養時間與原生質體量的關系

圖3　酶質量濃度與原生質體量的關系

2.3.3酶解時間在質量濃度為2.5 g/mL崩潰酶+0.05 g/mL溶壁酶的酶解液中酶解菌絲，菌絲分別酶解2、2.5、3和3.5 h。當菌絲酶解3 h時，獲得的原生質體數量最多，達到3.21×106mL-1(圖4)。酶解時間過短，菌絲未被酶解完全，得到原生質體數量少；而酶解時間過長，已形成的原生質體會被酶破壞，導致原生質體數量減少；同時，酶解時間過長會導致原生質體再生困難。

2.3.4滲透壓穩定劑濃度滲透壓穩定劑起保護作用時，需要一定濃度，其濃度過高或過低都會最終影響原生質體的產量和質量。濃度過低時，原生質體釋放后體積較大，容易破裂；而濃度較高時，不利于原生質體的釋放，且形成的原生質體較小，對再生和轉化效率都有影響。試驗中，分別使用濃度為0.7 、0.8、1、1.2和1.4 mol/L的KCl溶液作為滲透壓穩定劑。結果表明，使用濃度為0.8 mol/L的KCl溶液為滲透壓穩定劑時，獲得原生質體量最多，達2.8×106mL-1(圖5)。

圖4　酶解時間與原生質體量的關系

圖5　穩滲劑濃度與原生質體量的關系

2.4果生刺盤孢轉化子的驗證

將所有果生刺盤孢的轉化子在含潮霉素B的PDA培養基上連續培養5代后，發現所有轉化子仍表現出對潮霉素B的抗性，表明hph基因已經插入基因組中，并隨著菌絲的有絲分裂能夠穩定遺傳。利用潮霉素磷酸轉移酶基因的特異性引物H850和H852對上述轉化子進行PCR檢測，結果顯示，所有轉化子和質粒對照均能擴增到750 bp大小的特異性條帶，而在野生型菌株中未擴增到目標片段，初步證明潮霉素磷酸轉移酶基因成功插入并整合到果生刺盤孢基因組中，并且具有遺傳穩定性(圖6)。

以潮霉素磷酸轉移酶基因片段(750 bp)為探針，對果生刺盤孢的轉化子進行Southern blot雜交分析，由圖7可知，野生型菌株SQ06-E未能雜交到任何條帶，但質粒對照和7個轉化子均可雜交到特異性條帶，由此證明hph基因已整合到果生刺盤孢基因組中，其中轉化子SA3、SD12、SB14、SC11、SD9和SD11都有多拷貝插入，只有轉化子SA7為雙拷貝插入。

M.DL2000 DNA marker;CK.質粒pCB1003Plasmid pCB1003; W.野生型菌株SQ06-EWide-type strain SQ06-E; 1～15.轉化子Transformants

圖6果生刺盤孢部分轉化子的PCR檢測結果

Fig.6 PCR detection results of partial transformants

ofColletotrichumfructicolastrain SQ06-E

M.DNA 分子量標準λ-Hind Ⅲλ-Hind Ⅲ digest DNA Marker; CK.質粒pCB1003Plasmid pCB1003; 1～7.轉化子SA3、SD12、SB14、SC11、SD11、SD9和SA7Transformants SA3,SD12,SB14,SC11,SD11,SD9 and SA7; 8.野生型菌株SQ06-EWide-type strain SQ06-E

圖7 果生刺盤孢部分轉化子的Southern blot分析

Fig.7Southern blot analysis of transformants

ofColletotrichumfructicolastrain SQ06-E

3討 論

1990年刺盤孢屬第1次國際研討會在英國巴斯大學舉行，匯集分類學、分子生物學、植物免疫和病理學各領域的專家，這次會議促進分子生物學技術在刺盤孢領域的大規模應用[28]。自此以后，隨著多基因分子系統學的發展和應用，刺盤孢屬的系統分類發生巨大變化[6-7,29]，作為引起蘋果炭疽類病病原菌的刺盤孢也被重新定義，以前被認為是蘋果炭疽病病原菌的膠孢刺盤孢實際上為多種刺盤孢的復合群。本試驗將其中的果生炭疽菌作為供試菌株，建立蘋果果生刺盤孢的遺傳轉化體系。

農桿菌介導的轉化(ATMT)和PEG介導的原生質體轉化是常用的真菌轉化方法。由于ATMT方法具有轉化率高和單拷貝插入等優點，在過去的10 a中，該方法在各種真菌中被廣泛應用。但是，作為基因敲除等研究的基礎，該方法需要反復構建載體以適應不同的敲除片段，過于繁瑣。而PEG介導的原生質體轉化是應用較早和較普遍的方法，該方法操作簡便，能夠有效、準確的敲除目的基因。因此，本研究對PEG介導的蘋果果生刺盤孢原生質體轉化過程中的條件進行優化，獲得1個穩定、高效的轉化體系，為后續果生刺盤孢致病基因功能研究奠定基礎。

Cappellini等[25]發現在震蕩條件下羧甲基纖維素(Carboxymethylcellulose，CMC)能使不產孢的Gibberellazeae產生大孢子，在其他真菌中也發現含有纖維素的物質能夠誘導產孢[30]。本試驗中，果生刺盤孢SQ06-E在固體培養基上不產孢，故采用CMC培養基誘導產孢，結果發現CMC同樣能在震蕩條件下誘導果生刺盤孢產生大量分生孢子。由于CMC是天然維生素羧甲基化的產物，難分解，不能為真菌孢子萌發提供碳源，同時它還具有良好的乳狀、打散、懸浮和粘連作用，這使得誘導產生的分生孢子在培養基中均勻懸浮且不萌發。因此，使用CMC培養基震蕩促進產孢的同時可以抑制分生孢子萌發，這就可以保證萌發的分生孢子處于同一生長發育階段，適于進一步的原生質體制備。

原生質體的數量和質量直接影響轉化效率。在原生質體制備過程中，菌齡和菌量都會影響原生質體的產量。Chen等[23]用YPSS培養基靜置培養C.trifolii的分生孢子5～7 d后制備原生質體；Takano等[20]用PSY培養基震蕩培養C.lagenarium的分生孢子3 d后制備原生質體；Redman等[26]用M3S培養基震蕩培養C.lindemuthianum、C.magna和C.coccodes的分生孢子48 h后制備原生質體。本試驗中使用M3S培養分生孢子，孢子培養6 h后，由于孢子萌發的菌絲太短，用MiraCloth無法收集到幼嫩菌絲，而孢子培養8 h后，菌絲長度和收集的菌量都能滿足制備原生質體的條件。由此看來，不同種刺盤孢分生孢子的萌發條件和萌發速度都存在較大差異。同時，在液體培養基中，果生刺盤孢分生孢子的產生和萌發都需要震蕩來提供氧氣。

PEG介導的原生質體轉化方法具有隨機插入多個拷貝的特點，本試驗的Southern blot雜交分析表明，外源基因hph已經成功插入隨機選擇的7個轉化子的基因組中，只有轉化子SA7中僅有2個拷貝的插入，而其他6個轉化子中都有多于2個拷貝的插入，這與PEG介導的原生質體轉化方法的特點完全吻合。在獲得突變再生的菌絲后，使用有效的選擇標記獲得轉化子是關鍵步驟，本試驗選擇的潮霉素B抗性標記基因hph是目前使用較為廣泛的選擇標記。對于黃瓜炭疽病菌(C.lagenarium)[21]、鱷梨炭疽病菌(C.gloeosporioides)[31]、有節黧豆炭疽病菌(C.gloeosporioides)[32]、楊樹炭疽病菌(C.gloeosporioides)[33]等的生長有良好的抑制效果，抑制質量濃度為50～300 mg/L。本試驗中，30 mg/L的潮霉素B即可完全抑制蘋果炭疽菌的生長。而王海艷等[34]測得的潮霉素B對蘋果炭疽病菌(C.gloeosporioides)生長完全抑制的最低質量濃度為300 mg/L。由此看來，潮霉素B對刺盤孢屬不同種的生長抑制存在差異，對同一復合群下不同種的刺盤孢生長抑制也存在差異。這可能與刺盤孢屬種間和復合種內的生理特性差異有關。

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Received 2015-06-01Returned2015-09-12

Foundation itemThe National Natural Science Foundation of China (No.31171797).

First authorHAN Xiaolu,female,master student.Research area:plant pathology and mycology.E-mail: hanxiaolugood@163.com

SUN Guangyu,male,Ph.D,professor.Research area: plant pathology and mycology.E-mail：sgy@nwsuaf.edu.cn

(責任編輯：顧玉蘭Responsible editor:GU Yulan)

>PEG-Mediated Transformation ofColletotrichumfructicola

HAN Xiaolu，BAI Jingke，ZHANG Wei，ZHANG Rong and SUN Guangyu

(State Key Laboratory of Crop Stress Biology for Arid Areas,College of Plant Protection,Northwest A&F University,Yangling Shaanxi712100,China)

AbstractTo establish the PEG-mediated transformation technology system of Colletotrichum fructicola,we used the fresh hypha of Colletotrichum fructicola strain SQ06-E as recipient and then transformed a plasmid pCB1003 harboring the hygromycin B phosphotransferase gene (hph) into the protoplast of SQ06-E mediated by PEG (polyethylene glycol).The obtained transformants were screened and identified by hygromycin B resistance,PCR and method of Southern Blot analysis.The optimal transformation conditions were that 1×106 spores per milliliter of Colletotrichum fructicola spore suspension were shocked in M3S medium for 8 h in 200 r/min at 28 ℃; collecting 0.5 g hypha and hydrolyzing them in 10 mL enzyme solution which contained 0.25 g/mL Driselase and 0.05 g/mL Lysing enzyme for 3 h;using 0.8 mol/L KCl as the osmotic pressure stabilizer in all experiments.76 transformants have been get and the efficiency reached to 3-4 transformants per microgramme.DNA.Analysis of the transformants by PCR and Southern Blot showed that the selectable marker gene hph was integrated effectively into the genome of Colletotrichum fructicola.After 5 subculturing on PDA,all transformants could grow.This stability test of transformants suggested that the foreign gene hph was stable in heredity.

Key wordsApple Glomerella leaf spot；Genetic transformation；Transformants identification

Corresponding authorZHANG Rong,female,professor.Research area:plant pathology and comprehensive management of apple disease.E-mail: rongzh@nwsuaf.edu.cn

中圖分類號S582.28；S432.1

文獻標志碼A

文章編號1004-1389(2016)03-0442-08

通信作者：張榮，女，教授，研究方向為植物病理學和蘋果病害綜合治理。E-mail：rongzh@nwsuaf.edu.cn

基金項目：國家自然科學基金(31171797)。

收稿日期：2015-06-01修回日期：2015-09-12

網絡出版日期：2016-03-06

網絡出版地址：http://www.cnki.net/kcms/detail/61.1220.S.20160306.1611.034.html

第一作者：韓小路，女，碩士研究生，研究方向為植物病理學和真菌學。E-mail：hanxiaolugood@163.com

孫廣宇，男，教授，研究方向為植物病理學和真菌學。E-mail：sgy@nwsuaf.edu.cn