鴨源PKC基因熒光定量PCR檢測方法的建立

羅　樂，趙　碧，鄭　敏，吳良濤，文　明,2

(1. 貴州大學 動物科學學院，貴陽　550025；2. 貴州省動物疫病與獸醫公共衛生重點實驗室，貴陽　550025)

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鴨源PKC基因熒光定量PCR檢測方法的建立

羅樂1，趙碧1，鄭敏1，吳良濤1，文明1,2

(1. 貴州大學 動物科學學院，貴陽550025；2. 貴州省動物疫病與獸醫公共衛生重點實驗室，貴陽550025)

摘要為建立基于鴨源宿主細胞的蛋白激酶PKC基因的實時熒光定量PCR檢測方法。根據GenBank數據庫的PKC基因設計、合成特異性引物，通過PCR技術擴增目的基因片段，構建重組質粒GV pXT19-T-PKC，并以其為陽性標準品建立熒光定量PCR檢測方法和標準曲線，進行重復性、特異性和敏感性驗證。結果顯示，熒光定量PCR標準曲線為y=-3.334 0x+44.199，相關系數為0.995 4，擴增效率為99.19%；熔解曲線僅出現單特異峰，未檢測到H5亞型/H7亞型/H9亞型禽流感病毒疫苗毒株、新城疫病毒和鴨肝炎病毒等參考毒株的核酸樣本的熒光信號。說明，建立的熒光定量PCR方法具有良好的穩定性、特異性和靈敏性。

關鍵詞實時熒光 PCR；蛋白激酶C；SYBR Green Ⅰ

鴨腸炎病毒(Duck enteritis virus，DEV)是阻礙水禽養殖業發展的重要病原之一[1]。目前，對該病毒的研究雖然取得多方面進展，但其致病機制尚未完全清楚。該病毒主要通過與宿主相互作用而致病，但有關宿主細胞對DEV感染的應答，尤其是病毒蛋白受體的研究較少。貴州大學動物疫病研究室在前期研究中通過構建DEV基因文庫，發現并鑒定核衣殼蛋白(Nucleocapsid protein，NP)[2]，隨后通過酵母雙雜交系統篩選并鑒定核衣殼蛋白在鴨宿主細胞的受體為蛋白激酶C抑制蛋白(Protein kinase C inhibitor，PKCI)[3]。

PKCI是PKC在宿主細胞內的抑制蛋白質，也是DEV在宿主細胞內的受體。有研究表明，蛋白激酶C(Protein kinase C，PKC)是一類由多基因編碼，分子質量約80 ku的多肽類物質，屬于Ser/Thr蛋白激酶家族，參與細胞內多種功能的信號轉導，如增殖、分化和凋亡等。有學者在研究禽流感病毒[4]、新城疫病毒[5]和博納病病毒[6]時發現，宿主細胞的蛋白激酶與病毒增殖存在一定關系，即宿主細胞的蛋白激酶通過調節病毒蛋白的磷酸化，影響病毒蛋白分布，進而改變病毒的復制轉錄過程，但PKCI通過PKC影響DEV增殖的機制尚不清楚。由于實時熒光定量 PCR(Real-time fluorescent quantitative PCR，FQ-PCR)技術是當前分析基因表達差異的重要方法，具有實時性、特異性強、準確性和靈敏度高等特點，已廣泛應用于生命科學研究的各個領域[7]。因此，有必要建立針對鴨源PKC基因的FQ-PCR檢測方法，為進一步研究闡明PKCI及PKC對DEV增殖影響的作用機制奠定基礎。

1材料與方法

1.1毒株與細胞

鴨腸炎病毒GZ株(DEV-GZ)，由貴州省動物疫病與獸醫公共衛生重點實驗室提供。鴨胚成纖維細胞，由貴州省動物疫病與獸醫公共衛生重點實驗室通過傳統方法制備。

1.2主要試劑

E.coliDH5α，由貴州省動物疫病與獸醫公共衛生重點實驗室提供；克隆載體 pMD19-T Vector、膠回收試劑盒、PrimeScriptTMRT Master Mix(Perfect Real Time)和MiniBEST Universal RNA Extraction Kit試劑盒等，均購自TaKaRa 公司；質?？焖偬崛≡噭┖蠩. Z. N. A.TMPlasmid Mini Kit，購自Omega公司。

1.3引物設計與cDNA合成

根據GenBank數據庫的PKC基因mRNA序列，采用Primer 5.0軟件設計PKC基因引物，PKCF：5′-AAAGGATAATGTGGGGTAT-3′；PKCR：5′-TGAAAGACACTGGTGACAC-3′。預擴增片段大小為213 bp，由北京鼎國昌盛生物技術有限責任公司合成。

采用MiniBEST Universal RNA Extraction Kit試劑盒提取鴨肝臟組織總RNA，并以此為模板，通過PrimeScriptTMRT Master Mix(Perfect Real Time)反轉錄試劑盒合成cDNA，保存，待用。

1.4PKC標準陽性質粒的制備

1.4.1目的基因擴增與回收采用常規 PCR 方法擴增PKC基因。反應體系：1.0 μL cDNA，上、下游引物各0.5 μL，2.5 μL 2×TaqPCR Master Mix反應液，ddH2O補至25.0 μL。反應條件：94 ℃預變性2 min；94 ℃變性30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，35個循環；72 ℃延伸10 min。反應結束后取5 μL產物進行15 g/L瓊脂糖凝膠電泳，回收PCR 產物。

1.4.2重組質粒構建將回收的目的產物連接至PMD-19T載體，并轉化至E.coliDH5α，采用含氨芐西林的LB瓊脂平板，通過藍白斑篩選出白色菌落進行大量培養，提取重組質粒GV pXT19-T-PKC，經雙酶切和測序鑒定后，將陽性重組質粒GV pXT19-T-PKC作為實時熒光定量PCR標準品。

1.5標準曲線繪制

測定陽性重組質粒的OD260和OD280，計算重組質粒的DNA濃度，并計算質粒拷貝數：拷貝數=(6.02×1023×質粒DNA濃度)/(DNA長×109×660)。

熒光定量PCR標準曲線繪制：取陽性重組質粒作10倍梯度稀釋，以不同稀釋度陽性重組質粒為模板進行定量PCR反應，通過熒光定量PCR儀測定Ct值。以起始拷貝數為橫坐標(x)，Ct值為縱坐標(y)繪制標準曲線。

1.6重復性驗證

取1 μL拷貝數為3.52×103～3.52×1010的標準陽性質粒為模板，分別進行3次PCR檢測，根據Ct值驗證其重復性。PCR反應條件：94 ℃預變性2 min；94 ℃變性30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，35個循環；72 ℃延伸10 min。

1.7敏感性驗證

分別以1 μL拷貝數為3.52×100～3.52×101的標準陽性質粒和1 μL拷貝數為3.52×103～3.52×107的標準陽性質粒為模板進行定量PCR反應，驗證該方法的敏感性。單位體積拷貝數越小，敏感性越好。PCR反應條件同“1.6”。

1.8特異性驗證

選擇H5亞型/H7亞型/H9亞型禽流感疫苗毒株、新城疫病毒和鴨肝炎病毒為參考毒株，提取參考毒株的核酸，驗證建立的熒光定量PCR方法的特異性。

2結果與分析

2.1PKC標準陽性質粒的制備

2.1.1目的基因擴增采用引物 PKCF/PKCR，以反轉錄獲得的cDNA為模板進行PCR擴增，得到213 bp的目的條帶，與理論擴增片段大小一致(圖1)，說明已成功擴增獲得目的基因。

M. DGL2000 Marker；1.PKC基因擴增產物PKCgene amplified product

圖1目的基因PCR擴增結果

Fig.1Result of target gene amplification

2.1.2菌落PCR鑒定藍白斑篩選培養后，挑取10個白色菌落，以載體引物M13-47/M13-48為菌落引物進行PCR鑒定，結果顯示，挑取的菌落為陽性(圖2)，說明重組質粒轉化成功。

2.1.3質粒PCR鑒定提取構建質粒并進行PCR鑒定和測序，結果顯示，獲得1條213 bp的目的條帶，與理論擴增片段大小一致，說明克隆序列與目的序列的同源性為100%(圖3)。

2.2標準曲線繪制結果分析

以1 μL拷貝數為3.52×105～3.52×1010的標準陽性質粒為模板進行定量PCR反應，結果顯示，PCR的擴增效率為99.19%，且模板Ct值(y)與起始拷貝數(x)滿足關系式：y=-3.334 0x+44.199，該標準曲線的斜率為-3.334 0，相關系數為0.995 4(圖4)，結合標準曲線方程可推算出起始拷貝數。

M. DGL2000 Marker；1～10. 菌落PCR產物PCR product ofE.coli

圖2菌落PCR鑒定結果

Fig.2Screen PCR results

M. DGL2000 Marker；1. 質粒PCR產物Product of plasmid PCR

圖3質粒PCR鑒定結果

Fig.3PCR amplification result of plasmid

2.3重復性驗證結果分析

選取1 μL拷貝數為3.52×103～3.52×1010的標準陽性質粒為模板進行3次熒光定量PCR擴增，結果顯示，其Ct值的重復性較好，在相同起始拷貝數下，3次重復試驗的Ct值與平均值的差值均不超過0.5(表1)，說明建立的熒光定量PCR方法具有較好的重復性。

圖4　PKC標準曲線的建立

起始拷貝數InitialcopynumberCt值 Ct-value第1次First第2次Second第3次Third平均值Average3.52×101010.7810.5310.5510.623.52×10914.4014.7514.5914.583.52×10817.8217.6617.6817.723.52×10720.1920.1820.3620.243.52×10625.0324.7424.8624.873.52×10527.2527.2627.1527.223.52×10429.1029.1228.8129.013.52×10335.0035.0035.0035.00

2.4特異性與敏感性驗證結果分析

以H5亞型/H7亞型/H9亞型禽流感病毒疫苗毒株、新城疫病毒和鴨肝炎病毒等參考毒株的核酸樣本為模版進行擴增，結果顯示，在參考毒株中均未檢測到擴增信號，且熔解曲線呈單一峰(圖5)，說明建立的熒光定量PCR方法具有良好的特異性。以系列稀釋度陽性重組質粒為模板進行定量PCR擴增，發現在3.52個拷貝數模板上能檢測到擴增信號(圖6-G)，說明建立的熒光定量PCR方法具有較高的敏感性。

圖5　熔解曲線

A～E. 3.52×103～3.52×107拷貝數擴增信號3.52×103-3.52×107copies amplification signal；F～G. 3.52×100～3.52×101拷貝數擴增信號3.52×100-3.52×101copies amplification signal；H. 參考毒株Reference strains

圖6特異性與敏感性檢測

Fig.6Result of specificity and sensibility

3討 論

熒光定量PCR技術是將DNA熒光結合染料或特異性熒光探針加入PCR反應體系，通過熒光信號強弱實時監測整個PCR過程的一種PCR技術[8]。常用的熒光定量PCR技術有絕對定量PCR和相對定量PCR 2種。絕對定量PCR法一般是通過已知濃度的標準品繪制標準曲線，然后在相同的條件下檢測目的基因的熒光信號量，再根據標準曲線計算目的基因的絕對量[9]；而相對定量PCR方法是計算一定樣本中靶序列相對于參照基因量的變化量，再根據通過基因與參照基因的比值反映目的基因的變化[10]。目前，FQ-PCR方法是常用的相對定量PCR技術，已廣泛應用于家畜、家禽和水產動物等病原的快速檢測，并取得較好的應用效果[11-13]。

選擇熒光染料是建立相對定量PCR方法的關鍵。SYBR GreenⅠ熒光染料可以與雙鏈DNA特異結合，熒光信號強弱與PCR產物的量呈正相關，且應用簡便，無需設計探針，可降低檢測成本，但該熒光染料也可與非特異DNA片段結合產生假陽性信號，因此，在優化反應條件時需結合熔解曲線分析軟件檢測是否存在引物二聚體干擾。本研究選擇SYBR GreenⅠ作熒光染料，且在檢測其熔解曲線時發現，整個過程只出現單一波峰，說明建立的SYBR Green I 熒光定量PCR方法無假陽性信號。

相關系數、斜率值和擴增效率是衡量實時熒光定量PCR方法優劣的重要指標。理想的實時熒光定量PCR方法建立的曲線的相關系數接近1，斜率值為-3.5～-3.0，擴增效率為90%～110%，而本研究建立的鴨源PKC基因實時熒光定量PCR方法，其曲線的相關系數為0.996 4，斜率為-3.334 0，擴增效率為99.19%，說明該方法達到實時熒光定量PCR標準要求，可用于后續研究。

參考文獻Reference：

[1]殷震,劉景華.動物病毒學[M].第2版.北京:科學出版社,1997:1073-1077.

YIN ZH,LIU J H.Animal Virology[M].2nd Edition.Beijing:Sceince Press,1997:1073-1077(in Chinese).

[2]文明.DEV基因文庫構建、核衣殼蛋白基因的發現及克隆與表達[D].四川雅安:四川農業大學,2005.

WEN M.Construction ofDEVgene liberay and discover and cloning and expression of its nucleocapsid protein gene[D].Ya’an Sichuan:Sichuan Agricultural University,2005(in Chinese with English abstract).

[3]張荷,毛君婷,楊穎,等.鴨腸炎病毒核衣殼蛋白受體的篩選與鑒定[J].病毒學報,2012,28(1):63-66.

ZHANG H,MAO J T,YANG Y,etal.Screening and identification of receptor reacting with nucleocapsid protein of duck enteritis virus[J].ChineseJournalofVirology,2012,28(1):63-66(in Chinese with English abstract).

[4]HE Y,XU K,KEINER B,etal.Influenza a virus replication induces cell cycle arrest G0/G1 phase[J].JournalofVirology,2010,84(24):12832-12840.

[5]詹媛,陳鴻軍,仇旭升,等.宿主細胞磷酸激酶在新城疫病毒感染中的作用[J].中國動物傳染病學報,2011,19(2):1-7.

ZHAN Y,CHEN H J,QIU X SH,etal.The role of phosphokinase from host cells in the infection of newcastle disease virus[J].ChineseJournalofAnimalInfectiousDiseases,2011,19(2):1-7(in Chinese with English abstract).

[6]SONJA S,PHILIPPE M,CHRISTINE M A P,etal.Protein kinase C dependent phosphorylation of Borna disease virus protein in required for efficient viral spread[J].ArchivesofVirology,2010,155(5):789-793.

[7]KHEIFETS V,MOCHLY-ROSEN D.Insight into intra- and inter-molecular interactions ofPKC:design of specific modulators of kinase function [J].PharmacologicalResearch,2007,55(6):467-476.

[8]陳旭,齊鳳坤,康立功,等.實時熒光定量PCR技術研究進展及其應用[J].東北農業大學學報,2010,41(8):148-155.

CHEN X,QI F K,KANG L G,etal.Advance and application of real-time fluorescent quantitative PCR[J].JournalofNortheastAgriculturalUniversity,2010,41(8):148-155(in Chinese with English abstract).

[9]SCHMITTGEN T D,LIVAK K J.Analyzing real-time PCR data by the comparative CT method [J].NatureProtocols,2008,3(6):1101-1108.

[10]鐘江華,張光萍,柳小英.實時熒光定量PCR技術的研究進展與應用[J].氨基酸和生物資源,2011,33(2):68-72.

ZHONG J H,ZHANG G P,LIU X Y.Development of real-time fluorescent quantitative PCR and its application[J].AminoAcids&BioticResources,2011,33(2):68-72(in Chinese with English abstract).

[11]黃萍,肖家勇,歐陽振宇,等.非洲豬瘟病毒實時熒光定量PCR檢測方法的建立[J].中國動物檢疫,2010,27(11):27-30.

HUANG P,XIAO J Y,OUYANG ZH Y,etal.Development of a real-time fluorescent quantitative PCR method for rapid detection of African swine fever virus[J].ChineseJournalofAnimalQuarantine,2010,27(11):27-30(in Chinese with English abstract).

[12]楊利,曹三杰,文心田,等.實時熒光定量PCR檢測胸膜肺炎放線桿菌方法的建立及應用[J].農業生物技術學報,2010,18(5):1024-1030.

YANG L,CAO S J,WEN X T,etal.Development and application of real-time fluorescent quantitative PCR assay to detectActinobacilluspleuropneumoniae[J].JournalofAgriculturalBiotechnology,2010,18(5):1024-1030(in Chinese with English abstract).

[13]趙碧,熊朝麗,徐茂文,等.鴨腸炎病毒核衣殼蛋白質互作蛋白質基因熒光定量PCR檢測方法的建立[J].江蘇農業學報,2015,31(2):389-393.

ZHAO B,XIONG CH L,XU M W,etal.Establishment of a real-time fluorescent quantitative PCR method for detecting the interacting protein (PKCI) gene of nucleocapsid protein of duck enteritis virus[J].JiangsuJournalofAgriculturalScience,2015,31(2):389-393(in Chinese with English abstract).

Received 2015-07-15Returned2015-10-25

Foundation itemThe National Natural Science Foundation of China (No. 31260607,31560703); the Guizhou Youth Science and Technology Foundation (Grant No.Qiankehe Renzi[2013]25th); Guizhou Science and Technology Innovation Talents Team(Grant No.Qiankehe Talents Team[2015]4016th).

First authorLUO Le, male, master student.Research area:micrbiology and immunology.E-mail:499639895@qq.com

(責任編輯：郭柏壽Responsible editor:GUO Baishou)

Establishment of Real-time Fluorescence Quantitative PCR Method for DetectingPKCGene in Duck

LUO Le1, ZHAO Bi1, ZHENG Min1, WU Liangtao1and WEN Ming1,2

(1. Colleg of Animal Science, Guizhou University, Guiyang550025, China; 2.Key Laboratory of Animal Disease and Veterinary Public Health of Guizhou Province, Guiyang550025, China)

AbstractTo develop a SYBR GreenⅠ Real-Time PCR method assay for detecting the PKC gene in duck, the specific primers were designed and synthesized accorded to the PKC gene in the GenBank. and the target gene fragment obtained by PCR. Then the recombinant plasmid GV pXT19-T-PKC were constructed. The real-time fluorescent quantitative PCR method and the standard curve were established, then analyzed its reproducibility, specificity and sensitivity. The linear relationship of standard curve was y=-3.334 0x+44.199, and the correlation coefficient was 0.995 4, the amplification efficiency was 99.19%. There were a single specific peak appeared in the melting curve, and the fluorescence signal were not detected in the H5, H7, and H9 subtype of avian influenza virus, Newcastle disease virus and duck hepatitis virus.All the results indicated the Real-Time fluorescent quantitative PCR method for PKC gene in ducks is excellent stability, specificity and sensitivity.

Key wordsFluorescence quantitative PCR; Protein kinase C; SYBR GreenⅠ dye

Corresponding authorWEN Ming, male,Ph.D,professor.Research area:micrbiology and immunology.E-mail:as.mwen@gzu.edu.cn

中圖分類號S852.4

文獻標志碼A

文章編號1004-1389(2016)03-0342-05

通信作者：文明，男，博士，教授，從事獸醫微生物學與免疫學研究。E-mail：as.mwen@gzu.edu.cn

基金項目：國家自然科學基金(31260607；31560703)；貴州省優秀青年科技人才培養計劃[黔科合人字(2013)25號]；貴州省科技創新人才團隊[黔科合人才團隊(2015)4016號]。

收稿日期：2015-07-15修回日期：2015-10-25

網絡出版日期：2016-03-06

網絡出版地址：http://www.cnki.net/kcms/detail/61.1220.S.20160306.1610.008.html

第一作者：羅樂，男，碩士研究生，研究方向為獸醫微生物學與免疫學。E-mail：499639895@qq.com