H2S對腸缺血-再灌注損傷大鼠凝血功能異常的影響

盧根林，吳愛兵，王宏賓（.義烏市中心醫院 普通外一科，浙江 金華 000；.廣東醫學院附屬醫院 腫瘤中心，廣東 湛江5808；.青海大學附屬醫院 肝膽胰外科，青海 西寧 8000）

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H2S對腸缺血-再灌注損傷大鼠凝血功能異常的影響

盧根林1，吳愛兵2，王宏賓3
（1.義烏市中心醫院 普通外一科，浙江 金華 322000；2.廣東醫學院附屬醫院 腫瘤中心，廣東 湛江523808；3.青海大學附屬醫院 肝膽胰外科，青海 西寧 810001）

［摘 要］目的：H2S對腸缺血-再灌注損傷大鼠凝血功能異常的影響及機制。方法：24只雄性Wistar大鼠隨機分為A（假手術）組、B（缺血-再灌注）組和C（缺血-再灌注+NaHS）組。建立大鼠腸缺血-再灌注損傷模型，再灌注前10 min C組大鼠經尾靜脈注入100 μmol/kg NaHS并以1 mg/（kg·h）速度靜脈維持到再灌注2 h。RT-PCR、流式細胞儀法分別檢測單核細胞蛋白酶激活受體-1（PAR-1）、PAR-3 mRNA及蛋白表達；ELISA法檢測血組織因子（TF）、TNF-α、組織型纖溶酶原激活物（t-PA）、纖溶酶原激活物抑制劑-1（PAI-1）；敏感硫電極法測定血H2S；檢測凝血VIII因子活性（FVIII：C）、血管性血友病因子（vWF）、纖溶酶原活性（PLG：A）、抗凝血酶活性（AT：A）、血小板計數。結果：C組PAR-1、PAR-1 mRNA、TF、TNF-α、FVIII：C、vWF、t-PA、PAI-1均低于B組、高于A組，差異有統計學意義（均P＜0.01）；C組H2S、PLG：A、AT：A低于A組、高于B組，差異有統計學意義（均P＜0.01）。H2S與PAR-1、PAR-1 mRNA、TF、TNF-α、FVIII：C、vWF、t-PA、PAI-1呈負相關（r=-0.58、-0.68、-0.62、-0.64、-0.73、-0.55、-0.57、-0.64，均P＜0.01），與PLG：A、AT：A呈正相關（r=0.57、0.61，均P＜0.01）。結論：H2S通過降低PAR-1、TF、TNF-α含量，改善大鼠腸缺血-再灌注損傷時的凝血功能異常。

［關鍵詞］腸缺血-再灌注損傷；硫化氫；凝血功能；大鼠

H2S由小腸組織胱硫醚-γ-裂解酶（CSE）催化L-半胱氨酸生成［1］，對腸缺血-再灌注損傷大鼠具有保護作用［1-2］，可改善腸缺血-再灌注損傷大鼠的凝血功能［3］，但具體機制未明。組織因子（TF）、單核細胞蛋白酶激活受體-1（PAR-1）、TNF-α表達上調加劇了炎癥級聯與凝血反應的惡性循環［4-5］。本文在大鼠腸缺血-再灌注損傷模型上，觀察大鼠凝血功能和血中TF、PAR-1、PAR-3、TNF-α含量的變化及H2S的影響。

1　材料和方法

1.1材料

1.1.1實驗動物：清潔級雄性Wistar大鼠24只，6周齡，體質量200～250 g，由浙江大學醫學院動物中心提供（動物合格證號：201001018），動物實驗方案經溫州醫科大學附屬義烏醫院動物倫理委員會審核并同意實施。

1.1.2主要試劑：敏感硫電極和PXS-270離子（上海雷磁儀器廠），組織型纖溶酶原激活物（t-PA）、纖溶酶原激活物抑制劑-1（PAI-1）、TF、TNF-α ELISA試劑盒、異硫氰酸熒光素（FITC）標記抗鼠PAR-1、PAR-3抗體試劑盒（美國Santa Cruz司），Trizol（美國Promega公司）。

1.2方法

1.2.1動物分組與處理方法：將大鼠隨機分為A（假手術）組、B（缺血-再灌注）組，C（缺血-再灌注+NaHS）組，每組8只。剖腹及游離腸系膜上動脈（SMA），無損傷動脈夾鉗夾B、C組大鼠SMA 60 min和再灌注120 min，建立大鼠腸缺血-再灌注損傷模型［1-2］。在再灌注前10 min C組大鼠經尾靜脈注入100 μmol/kg NaHS并以1 mg/（kg·h）速度靜脈維持到再灌注2 h。A、B組大鼠經尾靜脈注入相同體積的0.9%氯化鈉溶液，作用時間和持續時間均同C組［1-2］。實驗結束后處死大鼠，取血離心分離血漿。

1.2.2血漿H2S濃度測定：參照文獻［6-7］，敏感硫電極法測定血漿H2S濃度。

1.2.3血漿抗凝血酶活性（AT∶A）、纖溶酶原活性（PLG∶A）、檢測凝血VIII因子活性（FVIII∶C）、血管性血友病因子（vWF）、血小板測定：參照文獻［8-9］，Sysmex CA-1500自動血凝儀檢測血漿AT∶A、PLG∶A、FVIII∶C、vWF含量，血細胞分析儀測定血小板。

1.2.4PAR-1、PAR-3表達：參照文獻［4-5］，采集外周血單核細胞，于細胞懸液中加入1 μg/106細胞FITC標記抗鼠PAR-1、PAR-3抗體，4 ℃避光孵育15 min，加入2 mL PBS洗滌1次，加入0.4 mL PBS，流式細胞儀檢測其平均熒光強度。

1.2.5血漿TF、TNF-α、t-PA、PAI-1測定：嚴格按試劑盒說明，ELISA法檢測血漿TF、TNF-α、t-PA、PAI-1濃度。

1.2.6RT-PCR檢測大鼠單核細胞PAR-1、PAR-3 mRNA的表達：大鼠PAR-1引物序列為5’-CAGCTCCTGG CTGACACTCTTGTCGGC-3’（上游），5’-CGAGCAGGGTTTC ATTGAGCACAT-3’（下游），擴增片段為500 bP；PAR-3引物序列為5’-GGCTGGACAGGAGCCACGAT-3’（上游），5’-A GCGGTTGATGCTGATGCAGG-3’（下游），擴增片段為403 bP；內參β-actin引物序列為5’-AGGGGCCGG ACTCGTCATACT-3’（上游），5’-GGCGGCAACACCATGTACC CT-3’（下游），擴增片段為202 bp。采集外周血單核細胞，一步法提取血單核細胞總RNA，電泳見28、18 s條帶，以5 μg總RNA為模板，以Random Premier為引物進行反轉錄反應合成cDNA。PCR的反應條件為：95 ℃預變性3 min后，95 ℃變性30 s、（PAR-1）61 ℃/（PAR-3）58 ℃/（β-actin）55 ℃退火30 s、72 ℃延伸50 s共35個循環，72 ℃延伸7 min。PCR產物經1.5%瓊脂糖凝膠電泳，采用UVPGD800圖像分析處理系統進行分析，以PAR-1、PAR-3/β-actin值表示PAR-1、PAR-3 mRNA含量。

1.3統計學處理方法 采用SPSS13.0統計軟件進行分析。計量資料用±s表示，多樣本均數比較采用單因素方差分析，多樣本均數間兩兩比較用Q檢驗，相關性采用直線相關分析。P＜0.05為差異有統計學意義。

2　結果

2.1各組大鼠血FVIII：C、vWF、PLG：A、AT：A和血小板計數比較 C組FVIII∶C、vWF均顯著低于B組、高于A組，PLG∶A、AT∶A低于A組、高于B組（均P＜0.01），各組大鼠血小板計數比較差異無統計學意義（P＞0.05），見表1。

表1　各組大鼠FVIII∶C、vWF、PLG∶A、AT∶A、t-PA、PAI-1和血小板檢測（n=8，±s）

表1　各組大鼠FVIII∶C、vWF、PLG∶A、AT∶A、t-PA、PAI-1和血小板檢測（n=8，±s）

與A組比：aP＜0.01；與B組比：bP＜0.01

組別　FVIII∶C（%）　vWF（%）　PLG∶A（%）　AT∶A（%）　　血小板（×109/L）　t-PA（μg/L）　PAI-1（ng/L）A　 89.2±12.4ab　76.4± 8.2ab　78.4±8.7ab　87.1±9.5ab　18.4±3.2　 4.5±0.5ab　427.4±24.3abB　150.6±22.6ab　142.5±12.5ab　50.7±6.2ab　67.2±7.2ab　16.6±2.4　12.7±1.2ab　854.2±41.7abC　120.5±19.8ab　112.6± 9.7ab　61.3±5.4ab　74.6±6.7ab　17.2±1.8　 6.4±0.8ab　642.7±32.1ab

2.2各組大鼠血t-PA、PAI-1的變化 C組t-PA、PAI-1均顯著低于B組、高于A組（均P＜0.01），B組t-PA/PAI-1值顯著高于A和C組（P＜0.01），見表1。

2.3各組大鼠PAR-1、PAR-3、TF、TNF-α、H2S表達

C組PAR-1、PAR-1 mRNA、TF、TNF-α均顯著低于B組、高于A組，H2S低于A組、高于B組（均P＜0.01）；3組PAR-3表達差異無統計學意義（P＞0.05），見表2、圖1。

表2　各組大鼠H2S、PAR-1、PAR-3、TF、TNF-α檢測（n=8，±s）

表2　各組大鼠H2S、PAR-1、PAR-3、TF、TNF-α檢測（n=8，±s）

與A組比：aP＜0.01；與B組比：bP＜0.01

組別　H2S（μmol/L）　PAR-1（ng/L）　PAR-1 mRNA　 PAR-3（ng/L）　PAR-3 mRNA　 TF（ng/L）　TNF-α（ng/L）A　42.57±7.18ab　12.27±3.12ab　0.22±0.03ab　18.63±4.32　 0.27±0.02　 98.5±12.4ab　4.08±0.94abB　24.38±2.69ab　56.12±9.07ab　0.68±0.06ab　19.27±5.14　 0.26±0.03　 542.6±29.4ab　49.02±1.62abC　35.27±3.14ab　32.16±8.43ab　0.34±0.04ab　17.46±3.69　 0.28±0.04　 345.7±32.1ab　39.27±1.54ab

圖1　各組大鼠血單核細胞PAR-1、PAR-3 mRNA表達

2.4各指標的相關性 H2S與PAR-1、PAR-1 mRNA、TF、TNF-α、FVIII∶C、vWF、t-PA、PAI-1呈負相關（r= -0.58、-0.68、-0.62、-0.64、-0.73、-0.55、-0.57、-0.64，均P＜0.01），與PLG∶A、AT∶A呈正相關（r=0.57、0.61，均P＜0.01）。FVIII∶C、vWF、t-PA、PAI-1與PAR-1呈正相關（r=0.56、0.62、0.67、0.54，均P＜0.01），與PAR-1 mRNA呈正相關（r=0.53、0.57、0.56、0.64，均P＜0.01），與TF呈正相關（r=0.72、0.59、0.72、0.75，均P＜0.01），與TNF-α呈正相關（r=0.63、0.71、0.73、0.67，均P＜0.01）。PLG∶A、AT∶A與PAR-1呈負相關（r=-0.77、-0.69，均P＜0.01），與TF呈負相關（r=-0.61、-0.64，均P＜0.01），與TNF-α呈負相關（r=-0.55、-0.74，均P＜0.01）。

3　討論

缺血-再灌注損傷大鼠氧自由基、炎癥遞質、細胞因子［1-2］、內毒素等大量釋放引起血管內皮細胞功能損害。血管內皮損傷暴露的膠原纖維，與膠原受體糖蛋白、整合素或與膠原連接的vWF和整合素結合并黏附血小板［8-10］。血管內皮細胞和血小板α顆粒合成的糖蛋白vWF，保護FVIII的活性，促進血小板黏附于內皮細胞，形成穩定的不可逆轉的血栓；vWF和FVIII的增加反映了機體同時存在血管內皮細胞損傷和凝血系統的激活［8-10］。抗凝血酶（AT）是主要的生理性抗凝物質［8-9］。當機體凝血功能亢進、局部發生凝血時，與纖維蛋白結合的單鏈糖蛋白PLG，被組織纖溶酶原激活劑或單鏈尿激酶活化為纖溶酶，啟動纖溶系統［11-12］。t-PA/PAI-1是衡量纖溶功能的指標［11-12］。本研究結果顯示，B組FVIII∶C、vWF、t-PA、PAI-1、t-PA/PAI-1顯著高于A組，PLG∶A、AT∶A低于A組，表明大鼠腸缺血-再灌注損傷時血管內皮細胞損傷和凝血、纖溶系統激活，表現為凝血功能異常。

PAR-1、PAR-3是G蛋白偶聯受體家族中的重要成員，由凝血酶激活。PAR-1、PAR-3可激活血小板，促進血小板聚集，參與凝血過程，參與細胞因子、遞質的釋放；增加血管的滲出以及中性粒細胞的趨化，參與血管擴張、血管收縮、細胞增生等炎癥及變態反應的病理過程［13］。本研究發現：大鼠單核細胞可表達PAR-1、PAR-3，與Adams等［13］研究結果相一致。缺血-再灌注損傷大鼠小腸黏膜通透性增加，腸源性細菌移位［1-2］。機體在感染致病因子的刺激下，TF表達上調，啟動內、外凝血途徑激活凝血系統；TF與FVII結合形成TF-FVIIα復合物并激活凝血酶原形成凝血酶；TF-FVIIα復合物和凝血酶又可以結合單核細胞PAR-1，引起TNF-α的合成和釋放［4-5］。TNF-α激活細胞因子級聯反應［14］，誘導TF表達，加劇炎癥級聯與凝血反應的惡性循環［4-5］。本研究結果顯示B組TF、PAR-1、PAR-1 mRNA、TNF-α顯著高于A組，與PLG∶A、AT∶A負相關，與FVIII∶C、vWF、t-PA、PAI-1正相關，提示腸缺血-再灌注損傷大鼠PAR-1、TF、TNF-α表達上調，介導凝血功能異常。

H2S由小腸組織CSE催化L-半胱氨酸生成，對腸缺血-再灌注損傷大鼠小腸黏膜屏障、肝臟功能障礙起保護作用［1-2］；可改善腸缺血-再灌注損傷大鼠的凝血功能［3］。本研究結果顯示，A組血H2S顯著高于B組，表明內源性H2S對維持凝血功能正常發揮重要作用。本研究發現C組FVIII∶C、vWF、t-PA、PAI-1、t-PA/PAI-1顯著低于B組，PLG∶A、AT∶A、H2S顯著高于B組，提示予以外源性H2S供體（NaHS）后，血H2S濃度升高，改善大鼠腸缺血-再灌注損傷時的凝血功能異常。

本研究還發現：C組PAR-1、PAR-1 mRNA、TF、TNF-α顯著低于B組，而PAR-3基因表達量差異無統計學意義，提示H2S下調腸缺血-再灌注損傷大鼠PAR-1、TF、TNF-α表達。相關分析研究顯示，H2S與PAR-1、PAR-1 mRNA、TF、TNF-α、FVIII∶C、vWF、t-PA、PAI-1負相關，與PLG∶A、AT∶A正相關，H2S通過降低PAR-1、TF、TNF-α含量，進而改善大鼠腸缺血-再灌注損傷時的凝血功能異常。NaHS能否作為一種藥物用于治療大鼠腸缺血-再灌注損傷時的凝血功能異常，待進一步研究。

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（本文編輯：趙翠翠，丁敏嬌）

Effects of hydrogen sulfide on coagulation dysfunction in rats with intestinal ischemia-reperfusion injury

LU Genlin1，WU Aibing2，WANG Hongbin3. 1.The First Department of General Surgery，Yiwu Central Hospital，Jinhua，322000； 2.Oncology Center，the Affiliated Hospital of Guangdong Medical College，Zhanjiang，523808； 3.Department of Hepatopancreatobiliary Surgery，the Affiliated Hospital of Qinghai University，Xining，810001

Abstract:Objective: To study the effects of hydrogen sulfide on coagulation dysfunction in rats with intestinal ischemia-reperfusion injury and its mechanism. Methods: Twenty-four male Wistar rats were randomly divided into three groups （8 in each group）: sham operation group （group A），ischemia-reperfusion group （group B），ischemia-reperfusion and sodium hydrosulfide group （group C）. The animal model of intestinal ischemia-reperfusion was established. Rats in Group C were received sodium hydrosulfide （100 μmol/kg bolus+1 mg·kg-1· h-1infusion） 10 min prior to the onset of reperfusion. Expressions of PAR-1 and PAR-3 were detected by RT-PCR and flow cytometry. Serum H2S was tested by sensitive sulfide electrode. Serum TF，TNF-α，t-PA，PAI-1 were determined by ELISA. PLG:A，FVIII:C，vWF，AT:A，platelet were measured. Results: PAR-1，PAR-1 mRNA，TF，TNF-α，FVIII:C，vWF，t-PA，PAI-1 in group C were significantly higher than those in group A，predominantly lower than those in group B （P＜0.01）. H2S，PLG:A，AT:A in group C were sharply higher than those in group B，strikingly lower than those in group A （P＜0.01）. H2S negatively correlated with PAR-1，PAR-1 mRNA，TF，TNF-α，FVIII:C，vWF，t-PA，PAI-1 （r=-0.58，-0.68，-0.62，-0.64，-0.73，-0.55，-0.57，-0.64，P＜0.01），positively correlating with PLG:A，AT:A （r=0.57，0.61，P＜0.01）. Conclusion: H2S attenuates coagulation dysfunction in rats with intestinal ischemia-reperfusion injury by down-regulating PAR-1，TF，TNF-α.

Key words:intestinal ischemia-reperfusion injury； hydrogen sulfide； coagulation function； rats

作者簡介：盧根林（1973-），男，浙江龍游人，副主任醫師，碩士。

基金項目：國家自然科學基金青年科學基金資助項目（812016 72）；義烏市人才引進立項項目（2012-R-04）。

收稿日期：2015-09-14

［中圖分類號］R656.7

［文獻標志碼］A

DOI:10.3969/j.issn.2095-9400.2016.05.007