高溫大曲中高產(chǎn)糖化酶菌株的篩選鑒定及固態(tài)發(fā)酵條件優(yōu)化

魯 珍，劉家揚，諶馥佳，李恩中，楊 錕，張建設(shè)，郜勝勤（.黃淮學院生物工程系，河南 駐馬店 463000；.河南豫坡酒業(yè)有限責任公司，河南 西平 463900）

?

高溫大曲中高產(chǎn)糖化酶菌株的篩選鑒定及固態(tài)發(fā)酵條件優(yōu)化

魯 珍1，劉家揚1，諶馥佳1，李恩中1，楊 錕1，張建設(shè)2，郜勝勤2
（1.黃淮學院生物工程系，河南 駐馬店 463000；
2.河南豫坡酒業(yè)有限責任公司，河南 西平 463900）

摘 要：對高溫大曲中高產(chǎn)糖化酶菌株進行分離和鑒定，并對篩選得到的菌株進行發(fā)酵條件的優(yōu)化。結(jié)果表明：試驗前期獲得的8株產(chǎn)醬香菌株中GX06菌株產(chǎn)糖化酶能力最強，同等條件下其糖化酶活力為706.13 U/g；通過形態(tài)觀察及16S rDNA序列同源性分析，初步鑒定該菌株為Bacillus cereus；通過單因素和正交試驗確定該菌株的最佳產(chǎn)酶條件為：以尿素為最佳氮源，以麩皮為最佳碳源，初始pH值6.0，接種量9%，在50℃下發(fā)酵70 h后，其產(chǎn)物糖化酶活性可達917.03 U/g。

關(guān)鍵詞：高溫大曲；糖化酶；鑒定；優(yōu)化

醬香型白酒是在復雜的傳統(tǒng)釀造工藝條件下釀制出的具有獨特品味風格的白酒種類，在市場上深受高端消費者的青睞。高溫大曲作為醬香型白酒釀造中的發(fā)酵劑、糖化劑和生香劑，在釀酒時用曲量較大（約85%～95%）[1]，由于傳統(tǒng)生產(chǎn)工藝條件復雜，在采取固態(tài)發(fā)酵生產(chǎn)工藝時產(chǎn)酒率較低。而醬香型白酒產(chǎn)酒率低主要是由高溫大曲中微生物發(fā)酵產(chǎn)淀粉酶活力不高和糖化發(fā)酵不徹底所導致的，因此開展糖化酶發(fā)酵特性研究意義重大[2]。研究以試驗前期篩選的8株產(chǎn)醬香高溫大曲菌株為材料，進一步篩選以期獲得高產(chǎn)糖化酶的菌株，再通過單因素和正交試驗設(shè)計優(yōu)化固態(tài)發(fā)酵工藝確定最適產(chǎn)酶條件，旨在為后續(xù)的產(chǎn)糖化酶菌種改良以及糖化酶的開發(fā)、生產(chǎn)和應(yīng)用提供依據(jù)。

1　材料與方法

1.1試驗材料

1.1.1供試菌株 以實驗室前期篩選的8株產(chǎn)醬香細菌為供試菌株。

1.1.2發(fā)酵原料及試劑 發(fā)酵用的麩皮、高粱、黃豆均為市購，其他試劑有尿素、葡萄糖、蛋白胨、可溶性淀粉、NH4NO3、(NH4)2SO4、冰乙酸、乙酸鈉、3,5-二硝基水楊酸等，均為國產(chǎn)分析純。

1.1.3主要儀器設(shè)備 ZWY-240恒溫振蕩培養(yǎng)箱（上海智城分析儀器有限公司）；LDKM-40KCS立式壓力蒸汽滅菌鍋（上海申安醫(yī)療器械廠）；SW-CJ-2FD超凈操作臺（蘇州蘇潔凈化設(shè)備有限公司）；SHP-250FE智能生化培養(yǎng)箱（上海三發(fā)科學儀器有限公司）；JB5374-91電子天平（梅特勒-托利多儀器有限公司）；PHS-3C精密pH計（上海儀電分析儀器有限公司）。

1.1.4培養(yǎng)基 （1）營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基：牛肉膏5 g/L，蛋白胨 10 g/L，NaCl 5 g/L，瓊脂 20 g/L，pH值7.0。（2）種子液培養(yǎng)基：胰蛋白胨10 g/L，酵母提取物5 g/L，NaCl 10 g/L，pH值7.0。（3）斜面保藏培養(yǎng)基：牛肉膏 5 g/L，蛋白胨 10 g/L，NaCl 5 g/L，瓊脂 20 g/L，pH值7.0。（4）基礎(chǔ)固體發(fā)酵培養(yǎng)基：碳源 10 g，磷酸二氫鉀 0.02 g，硫酸鎂 0.02 g，氮源1 g，無菌水10 mL。（5）淀粉瓊脂培養(yǎng)基：蛋白胨1%，NaCl 0.5%，牛肉膏0.5%，瓊脂粉2%，可溶性淀粉2%。

1.2試驗方法

1.2.1平板透明圈法 將8株產(chǎn)醬香菌株接種到淀粉瓊脂培養(yǎng)基中培養(yǎng)12 h，溫度設(shè)定到50℃。然后滴加碘液于平板上，待顯色后測定透明圈直徑（D）和菌落直徑（d），計算兩者比值（HC）[3]。

1.2.2糖化酶菌株形態(tài)及生理生化實驗和功能菌株的鑒定 （1）形態(tài)及生理生化鑒定。形態(tài)學鑒定包括細菌平板菌落觀察和形態(tài)學觀察。生理生化鑒定參照《伯杰細菌鑒定手冊》第8版中芽孢桿菌屬特征選擇接觸酶、淀粉水解、檸檬酸鹽利用、V.P、MR、厭氧生長、pH值5.7生長等試驗項目。（2）功能菌種鑒定。以細菌16S rDNA擴增時的通用引物27F（5'-GAGCGGATAACAATTTCACACAGG-3'）和1492R（5'-TACGGTTACCTTGTTACGACTT-3'）為上下游引物，采用試劑盒法提取菌體總DNA。PCR擴增時反應(yīng)條件為：94 ℃ 5 min；94 ℃ 1 min，55 ℃ 1 min，72 ℃ 1.5 min，30 個循環(huán)；72 ℃ 5 min[4]。用膠回收試劑盒純化PCR 擴增產(chǎn)物，并送至南京金瑞生斯物工程有限公司測序。將最終測序結(jié)果在NCBI中進行BLAST比對，用Neighbor-Joining[5]構(gòu)建高產(chǎn)糖化酶菌株的系統(tǒng)發(fā)育樹。

1.2.3高產(chǎn)糖化酶菌株糖化酶活力的測定 將固體發(fā)酵產(chǎn)物加入pH值4.6的醋酸-醋酸鈉緩沖溶液中，混勻后經(jīng)濾紙過濾得到粗酶液。采用3,5-二硝基水楊酸法測定糖化酶活力[6]。葡萄糖標準曲線的回歸方程為y=0.587 1x-0.018 9，R2=0.991 4。

1.2.4高產(chǎn)糖化酶菌株發(fā)酵條件的單因素試驗 （1）碳源：在基礎(chǔ)固體發(fā)酵培養(yǎng)基（以黃豆粉為氮源）的基礎(chǔ)上，分別以麩皮、葡萄糖、高粱、可溶性淀粉為碳源，初始pH值為6.0，添加量為10 g，種子液接種量為5%，發(fā)酵溫度50℃，發(fā)酵時間為48 h，發(fā)酵結(jié)束后測定糖化酶活力。（2）氮源：以麩皮為優(yōu)勢碳源，分別選擇硝酸銨、硫酸銨、黃豆粉、蛋白胨、尿素為氮源配制固體發(fā)酵培養(yǎng)基進行發(fā)酵，添加量為1 g，初始pH值為6.0，種子液接種量為5%，發(fā)酵溫度50℃，發(fā)酵時間為48 h，發(fā)酵結(jié)束后測定糖化酶活力。（3）初始pH值：以麩皮為優(yōu)勢碳源，以尿素為優(yōu)勢氮源，初始pH值分別為5.0、6.0、7.0、8.0、9.0，種子液接種量為5%，發(fā)酵溫度50℃，發(fā)酵時間為48 h，發(fā)酵結(jié)束后測定糖化酶活力。（4）接種量：以碳源為麩皮，氮源為尿素配制培養(yǎng)基，初始pH值6.0，分別接入3%、 5%、7%、9%、11%的種子液，于50℃下發(fā)酵48 h，發(fā)酵結(jié)束后測定糖化酶活力。（5）發(fā)酵時間：以碳源為麩皮，氮源為尿素配制培養(yǎng)基，初始pH值6.0，接入9%的種子液，于50℃下，分別發(fā)酵12、24、36、48、60、72 h，以菌株產(chǎn)糖化酶活力為評價指標，確定最佳發(fā)酵時間。

1.2.5高產(chǎn)糖化酶菌株發(fā)酵條件的正交試驗 在單因素試驗結(jié)果的基礎(chǔ)上，以麩皮為碳源，以尿素為氮源，以菌株產(chǎn)糖化酶活力為評價指標，研究初始pH值、種子液接種量、發(fā)酵時間的最佳搭配，各因素的水平見表1。

表1　正交試驗的因素與水平

2　結(jié)果與分析

2.1高產(chǎn)糖化酶菌株的篩選結(jié)果

由表2可知，8株產(chǎn)醬香菌株中以GX06的透明圈與菌落直徑比值最大（8.74）；且糖化酶的活力最高，達到706.13 U/g，分別比其他菌株增加17.5%～69.9%。糖化是將發(fā)酵原料中的碳水化合物轉(zhuǎn)化成可發(fā)酵性糖的全過程，對產(chǎn)酒率影響較大。糖化后發(fā)酵液中還原糖含量的高低直接體現(xiàn)了糖化效果的好壞[7-8]。因此，選擇GX06高產(chǎn)糖化酶菌株作為糖化劑，可以提高白酒的出酒率。

表2　高產(chǎn)糖化酶菌株的篩選結(jié)果

2.2高產(chǎn)糖化酶菌株GX06的特征

2.2.1形態(tài)及生理生化特性 GX06菌株菌落顏色為灰白色，表面褶皺，菌落呈圓形，菌體革蘭氏染色后為紫色，可以確定為革蘭氏陽性菌，接觸酶陽性，能水解淀粉，并能夠利用檸檬酸鹽，V.P和MR試驗都為陽性，能在pH值5.7的環(huán)境中生長。初步確定為芽孢桿菌類，至于屬種，還需借助分子生物學手段進行鑒定。

2.2.2分子檢測鑒定 將GX06菌株測序所得的16S rDNA序列拼接后與GeneBank數(shù)據(jù)庫中的標準菌株進行比對，從中獲得與GX06菌株序列相近的種、屬序列，通過Mega5軟件構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，如圖1所示，GX06菌株與Bacillus cereus HN相似度為99%，初步鑒定為蠟樣芽孢桿菌。

圖1　菌株GX06系統(tǒng)發(fā)育樹

2.3高產(chǎn)糖化酶菌株產(chǎn)酶條件的單因素試驗結(jié)果

2.3.1氮源對產(chǎn)糖化酶活力的影響 如圖2所示，5種氮源中產(chǎn)糖化酶最多的是尿素，其酶活達523.51 U/ g，分別比硝酸銨、蛋白胨、黃豆、硫酸銨的酶活高37.81%，43.50%，48.29%，63.09%，說明尿素能促進GX06菌株發(fā)酵產(chǎn)糖化酶，是較適宜的氮源。

圖2　不同氮源處理發(fā)酵產(chǎn)物糖化酶活力的比較

2.3.2碳源對產(chǎn)糖化酶活力的影響 如圖3所示，在這4種碳源中以麩皮發(fā)酵產(chǎn)酶能力最高，酶活達478.195 U/g；其次是葡萄糖，酶活僅比麩皮低5%；而可溶性淀粉作碳源時，酶活最低，僅140.72 U/g。同時，麩皮發(fā)酵產(chǎn)酶的固體發(fā)酵產(chǎn)物褐變顏色最深，因此確定麩皮為GX06菌株發(fā)酵的最適碳源。

圖3　不同碳源處理發(fā)酵產(chǎn)物糖化酶活力的比較

2.3.3起始pH值對產(chǎn)糖化酶活力的影響 如圖4所示，當發(fā)酵液初始pH值為6.0時，GX06菌株的產(chǎn)酶能力最強，酶活最高達440.03 U/g，顯著高于其他處理。因此，確定發(fā)酵最適初始pH值為6.0。

圖4　不同初始pH值處理發(fā)酵產(chǎn)物糖化酶活力的影響

2.3.4接種量對產(chǎn)糖化酶活力的影響 如圖5所示，當接種量為9%時，發(fā)酵產(chǎn)物酶活達最大值（905.10 U/g）；繼續(xù)增加接種量，菌體越來越密集，培養(yǎng)基的消耗速度也不斷加快，資源和空間相對減少，不利于發(fā)酵產(chǎn)酶。因此，GX06菌株發(fā)酵時接種量不應(yīng)超過9%。

圖5　不同接種量處理發(fā)酵產(chǎn)物糖化酶活力的影響

2.3.5發(fā)酵時間對產(chǎn)糖化酶活力的影響 如圖6所示，隨著發(fā)酵時間的延長，GX06菌株的糖化酶活力逐漸增大，當發(fā)酵到約60 h時糖化酶活力最高，之后酶活的增加幅度減小，因此，選擇約60 h的發(fā)酵時間較合適。

圖6　不同發(fā)酵時間處理發(fā)酵產(chǎn)物糖化酶活力的影響

2.4高產(chǎn)糖化酶菌株產(chǎn)酶條件的正交試驗結(jié)果

由表3可知，3 種因素對糖化酶酶活的影響大小依次為發(fā)酵時間（C）＞pH值（A）＞接種量（B）。3個因素中，時間的影響差異顯著，接種量和pH的影響不顯著。在試驗設(shè)計范圍內(nèi)，優(yōu)化得到蠟樣芽孢桿菌GX06菌種產(chǎn)糖化酶的最佳條件為A2B2C3，即pH 值為6，接種量9%，發(fā)酵時間70 h。按A2B2C3條件進行3次平行試驗，測量酶活性平均值為917.03 U/g。

表3　正交試驗結(jié)果

3　結(jié) 論

經(jīng)過生理生化試驗和分子生物學鑒定，具有醬香功能同時產(chǎn)糖化酶能力高的GX06菌株為蠟樣芽孢桿菌，劉婧瑋[9]等也從高溫大曲中篩選出一株醬香功能菌，經(jīng)驗證也為蠟樣芽孢桿菌。由正交試驗結(jié)果可知，影響產(chǎn)糖化酶能力的發(fā)酵條件排序依次為發(fā)酵時間（C）＞pH值（A）＞接種量（B），在最佳條件即pH 值6.0，接種量9%，發(fā)酵時間70 h時，GX06菌株的糖化酶活力達917.03 U/g，預(yù)期采用此方法可大大增加出酒率。

利用糖化酶提高白酒的出酒率在很多酒廠已見成效，但也有一定的不足，比如單獨使用糖化酶會因為酶的單一導致白酒品質(zhì)差，口感不好[10]。因此，篩選能同時產(chǎn)生糖化酶和蛋白酶的菌株進行發(fā)酵，對提升醬香型白酒的風味效果會更好，能顯著增加酒中的特殊香味物質(zhì)和有益次級代謝產(chǎn)物，提升醬香型白酒的營養(yǎng)保健價值。黃永光等[11]獲得了一株高產(chǎn)糖化酶和蛋白酶的功能曲霉，該菌株不僅具有高產(chǎn)糖化酶、蛋白酶和多種風味酶類的特點，還具有促進、調(diào)節(jié)糖化、發(fā)酵和生香進程的作用。趙希玉等[12]從茅臺酒中分離得到的6株同時具有蛋白分解能力和糖化分解能力的醬香菌，將其制成強化大曲應(yīng)用于白酒釀造過程，最終發(fā)酵所產(chǎn)酒的品質(zhì)遠遠優(yōu)于未添加強化大曲釀制的白酒。這說明菌種產(chǎn)酶是多樣的，糖化酶只是其中一種。因此，該研究還將從多功能方面進一步挖掘GX06菌株的其他特性。

參考文獻：

[1] 崔 利. 大用曲量工藝與醬香型酒產(chǎn)質(zhì)量、風格的關(guān)系[J]. 釀酒，2008，35（3）：34-38.

[2] 張志剛，吳生文，陳 飛. 大曲酶系在白酒生產(chǎn)中的研究現(xiàn)狀及發(fā)展方向[J]. 中國釀造，2011，226（1）：13-16.

[3] 李銳利，方尚玲，陳茂彬，等. 綠衣觀音土曲中霉菌糖化酶活力的研究[J]. 釀酒，2010，37（1）：50-52.

[4] 曾德勇，方 鎰，劉 濤，等. 醬香型高溫大曲中高產(chǎn)蛋白酶細菌的分離及鑒定[J]. 釀酒科技，2015，249（3）：27-30.

[5] Ahmed I， Yokota A， Yamazoe A， et al. Proposal of Lysinibacillus boronitolerans gen. nov. sp. Nov， and transfer of Bacillus fusiformis to Lysinibacillus fusiformis comb. Nov.and Bacillus sphaericus to Lysinibacillus sphaericus comb. Nov[J]. Int J Syst Evol Microbiol，2007，57（5）：1117-1125.

[6] 沈玉潔. 高溫大曲中嗜熱功能菌的篩選及應(yīng)用性能研究[D]. 武漢：湖北工業(yè)大學，2011.

[7] 王立釗，梁慧珍，馬樹奎. 影響固態(tài)發(fā)酵白酒中雜醇油生成因素的研究[J]. 釀酒科技，2006，（5）：43-46.

[8] 張艷梅，王昌祿，郭坤亮，等. 酶對茅臺酒酒糟再利用的影響[J].釀酒科技，2005，（10）：81-82.

[9] 劉婧瑋，蔣英麗，沈 毅，等. 高溫大曲中一株醬香功能菌的分離鑒定及驗證[J]. 釀酒科技，2014，244（10）：19-22.

[10] 王旭亮. 白酒發(fā)酵高糖化性能霉菌的篩選及鑒定[J]. 釀酒科技，2012，（9）：22-28.

[11] 黃永光. 醬香型白酒釀造中Aspergillus hennebergii及其分泌酸性蛋白酶的研究[D]. 無錫：江南大學，2014.

[12] 趙希玉，趙 丹，趙 曄. 應(yīng)用純種微生物提高大曲醬香酒質(zhì)量工藝試驗[J]. 釀酒，2002，29（3）：36-38.

（責任編輯：成 平）

Filtering and Identifying of High-yield Glucoamylase Strains from High Temperature Daqu and Optimization of Solid State Fermentation Conditions

LU Zhen1，LIU Jia-yang1，CHEN Fu-jia1，LI En-zhong1，YANG Kun1，ZHANG Jian-she2，GAO Sheng-qin2
（1. Biological Engineering Department of Huanghuai University， Zhumadian 463000， PRC； 2.Henan Yupo Co.Ltd.， Xiping 463900， PRC）

Abstract：Isolate and identify high-yield glucoamylase strains from high temperature Daqu and optimize the fermentation conditions of filtered strains. The results showed that, the 8 Jiangxiang-producing strains obtained from early stage of test, the GX06 strain has the strongest ability of producing glucoamylase, activity of glucoamylase is 706.13 U/g under the same conditions; by morphological observation and rDNA 16S sequence homology analysis， the strain was identified as Bacillus cereus； the best enzyme production conditions of the strain were determined by single factor and orthogonal test: using urea as the best nitrogen source, using wheat bran as the best carbon source, initial pH value of 6.0, inoculation amount of 9%, after 70 h fermentation under 50℃, the glucoamylase activity of its production is up to 917.03 U/g.

Key words：high temperature Daqu； glucoamylase； identification； optimization

通訊作者：李恩中

作者簡介：魯 珍（1987-），女，河南駐馬店市人，助教，主要從事食品科學研究。

基金項目：國家青年自然科學基金項目（51503074）；2015年河南省重點科技攻關(guān)項目（152102210025）

收稿日期：2016-02-21

DOI:10.16498/j.cnki.hnnykx.2016.04.001

中圖分類號：Q93-3

文獻標識碼：A

文章編號：1006-060X（2016）04-0001-04