血府逐瘀湯對(duì)心肌梗死大鼠心肌發(fā)育相關(guān)基因GATA4、NKx2.5調(diào)控作用的研究

周　菁，張　焱，張　倩，鄧中龍，朱巖峰

(上海中醫(yī)藥大學(xué)附屬岳陽中西醫(yī)結(jié)合醫(yī)院，上海 200437)

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血府逐瘀湯對(duì)心肌梗死大鼠心肌發(fā)育相關(guān)基因GATA4、NKx2.5調(diào)控作用的研究

周菁，張焱，張倩，鄧中龍，朱巖峰

(上海中醫(yī)藥大學(xué)附屬岳陽中西醫(yī)結(jié)合醫(yī)院，上海 200437)

[摘要]目的觀察血府逐瘀湯對(duì)心肌梗死大鼠心肌發(fā)育相關(guān)基因GATA4、NKx2.5的調(diào)控作用。方法采用結(jié)扎大鼠左冠狀動(dòng)脈前降支方法建立心肌梗死模型，將成模大鼠隨機(jī)分為模型組和血府逐瘀湯組，每組30只。另選擇同月齡健康SD大鼠10只作為假手術(shù)組。模型組給予生理鹽水2 mL/次灌胃，血府逐瘀湯組給予濃煎血府逐瘀湯2 mL/次灌胃，均1次/d。采用RT-PCR方法檢測(cè)3組大鼠干預(yù)1 d、10 d、15 d心肌組織中GATA4、Nkx2.5mRNA表達(dá)水平。結(jié)果干預(yù)1d后，模型組GATA4、Nkx2.5mRNA表達(dá)量均明顯低于假手術(shù)組(P均<0.05)；干預(yù)10 d后，模型組和血府逐瘀湯組GATA4、Nkx2.5mRNA表達(dá)量與假手術(shù)組比較差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P均>0.05)，但模型組GATA4、Nkx2.5mRNA表達(dá)量和血府逐瘀湯組GATA4mRNA表達(dá)量均明顯高于干預(yù)1 d后(P均<0.05)；干預(yù)15 d后，血府逐瘀湯組GATA4、Nkx2.5mRNA表達(dá)量均明顯高于假手術(shù)組(P均<0.05)。干預(yù)1 d、10 d、15 d后，血府逐瘀湯組GATA4、Nkx2.5mRNA表達(dá)量均較模型組有所升高，但差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P均>0.05)。結(jié)論大鼠心肌梗死后，其心肌組織中GATA4、Nkx2.5mRNA表達(dá)量呈現(xiàn)先下降、再升高的趨勢(shì)。血府逐瘀湯可發(fā)揮一定的促進(jìn)心肌梗死大鼠心肌發(fā)育相關(guān)基因GATA4、NKx2.5表達(dá)增加的作用，該作用可能是祛瘀中藥促進(jìn)梗死后心肌組織迅速修復(fù)、愈合的機(jī)制之一。

[關(guān)鍵詞]血府逐瘀湯；心肌梗死；GATA4；Nkx2.5

我國目前聯(lián)用西藥及中藥綜合治療冠心病心肌梗死的方案很普遍。冠心病心肌梗死相當(dāng)于祖國醫(yī)學(xué)“胸痹心痛”“真心痛”范疇，而“胸痹心痛”“真心痛”以血瘀、痰濁作為標(biāo)實(shí)的特點(diǎn)已得到廣泛認(rèn)可。臨床上中醫(yī)藥專家針對(duì)冠心病“真心痛”的防治多從祛瘀化痰著手，且取得較好臨床療效[1-3]，但有關(guān)祛瘀中藥對(duì)梗死后心肌發(fā)育相關(guān)基因調(diào)控作用的實(shí)驗(yàn)研究卻相對(duì)較少。本研究選用《醫(yī)林改錯(cuò)》記載之血府逐瘀湯為代表方，觀察了該方對(duì)急性心肌梗死大鼠心肌組織中心肌發(fā)育相關(guān)基因GATA4、NKx2.5mRNA表達(dá)的影響，現(xiàn)將結(jié)果報(bào)道如下。

1實(shí)驗(yàn)資料

1.1動(dòng)物雄性SD大鼠70只，清潔級(jí)，體質(zhì)量(250±20)g。北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司提供，動(dòng)物合格證號(hào)：11400700038123。

1.2藥物血府逐瘀湯，組方：當(dāng)歸9 g、生地9 g、 桃仁12 g、紅花9 g、枳殼6 g、赤芍6 g、柴胡3 g、甘草3 g、桔梗4.5 g、川芎4.5 g、牛膝10 g。自動(dòng)煎藥機(jī)統(tǒng)一煎藥，控制時(shí)間及加水量，濃煎至生藥含量為1 g/mL。

1.3試劑及儀器Trizol(Invitrogen)；二乙基焦碳酸酯(DEPC，國藥)；引物合成(Invitrogen)；無水乙醇、氯仿、滅菌的DEPC 水、PCR master mix、逆轉(zhuǎn)錄試劑盒等(Biotnt)。微型離心機(jī)，GyroSpin(GYROZEN)；旋渦混合器，GL-88B(海門市其林貝爾儀器制造有限公司)；恒溫金屬浴，HB-100(杭州博日科技有限公司)；qPCR儀，ViiA7(life technology(ABI))；離心機(jī)，TDL-80-2B(飛鴿牌)；超細(xì)勻漿器，F(xiàn)6/10-6G(FLUKO(上海)流體機(jī)械制造有限公司)；移液器，10 μL/200 μL /1 000 μL(Dragonlab)。

1.4造模及給藥方法參考文獻(xiàn)[4-5]報(bào)道的造模方法，結(jié)扎大鼠左冠狀動(dòng)脈前降支。結(jié)扎前后記錄Ⅱ?qū)?lián)心電圖，以結(jié)扎部位以下心肌變蒼白、搏動(dòng)減弱且出現(xiàn)J點(diǎn)明顯抬高為造模成功。術(shù)后將存活大鼠隨機(jī)分為模型組和血府逐瘀湯組，每組30只。另選取預(yù)留的10只健康雄性SD大鼠作為假手術(shù)組。模型組給予生理鹽水2 mL/次灌胃，血府逐瘀湯組給予血府逐瘀湯2 mL/次灌胃，均1次/d。

1.5心肌組織中GATA4、Nkx2.5mRNA檢測(cè)方法分別于干預(yù)1 d、10 d、15 d后每組各處死10只大鼠，取心肌組織，以β-actin為內(nèi)參，從心肌組織中提取總RNA。以提取出的mRNA進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄，成為cDNA模板進(jìn)行RT-PCR實(shí)驗(yàn)。擴(kuò)增條件95 ℃ 5 min→95 ℃ 15 s→ 60 ℃ 30 s(讀熒光)→95 ℃ 15 s；60 ℃ 30 s(0.3 ℃/s)；95 ℃ 15 s，共進(jìn)行40個(gè)循環(huán)。

2結(jié)果

干預(yù)1 d后，模型組GATA4、Nkx2.5mRNA表達(dá)量均明顯低于假手術(shù)組(P均<0.05), 血府逐瘀湯組GATA4、Nkx2.5mRNA表達(dá)量有低于假手術(shù)組的趨勢(shì)，但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P均>0.05)；干預(yù)10 d后，模型組和血府逐瘀湯組GATA4、Nkx2.5mRNA表達(dá)量與假手術(shù)組比較差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P均>0.05)，但模型組GATA4、Nkx2.5mRNA表達(dá)量和血府逐瘀湯組GATA4mRNA表達(dá)量均明顯高于干預(yù)1 d后(P均<0.05)；干預(yù)15 d后，血府逐瘀湯組GATA4、Nkx2.5mRNA表達(dá)量均明顯高于假手術(shù)組(P均<0.05)。干預(yù)1 d、10 d、15 d后，血府逐瘀湯組GATA4、Nkx2.5mRNA表達(dá)量均較模型組有所升高，但差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P均>0.05)。見表1。

表1　各組大鼠干預(yù)后不同時(shí)間點(diǎn)GATA4、NKx2.5mRNA表達(dá)量比較

注：①與假手術(shù)組比較，P<0.05；②與干預(yù)1d比較，P<0.05。

3討論

急性心肌梗死是在冠狀動(dòng)脈粥樣硬化病變狹窄的基礎(chǔ)上由急性血栓形成而導(dǎo)致血管閉塞，使心肌嚴(yán)重而持久缺血壞死的一種疾病。從中醫(yī)角度來講，急性心肌梗死的發(fā)生過程類似出現(xiàn)了瘀血內(nèi)停、瘀滯不通的血瘀證，治宜活血化瘀。大多數(shù)專家推崇以“祛瘀生新”為治療指導(dǎo)原則，然而有關(guān)其“祛瘀”及“生新”的具體作用環(huán)節(jié)，現(xiàn)代實(shí)驗(yàn)研究還不夠詳盡。張金生[6]認(rèn)為“生新”層面包含“生新血、生新物、生新脈、化舊生新”4個(gè)方面。其中“生新物”是受損臟器“真氣”復(fù)生的過程，先天之精是新物再生的物質(zhì)基礎(chǔ)。其提出活血化瘀的“生新”是機(jī)體“復(fù)其真氣”之新。而作為心肌梗死后的心肌細(xì)胞再生，也需要機(jī)體“真氣修復(fù)”。因此，針對(duì)梗死后的心肌組織，從調(diào)控心肌細(xì)胞發(fā)育的基因?qū)用鎭硌芯繉⑹呛苡袉l(fā)的。

Linke等[7]研究認(rèn)為激活心臟原始細(xì)胞可顯著促進(jìn)梗死后受損組織的修復(fù)，而心肌發(fā)育相關(guān)基因GATA4和Nkx2.5在促使心臟原始細(xì)胞分化成心肌細(xì)胞中起重要作用。國內(nèi)有研究發(fā)現(xiàn)，在正常心肌中，基因GATA4、Nkx2.5有較強(qiáng)的表達(dá)；心肌梗死后，GATA4、Nkx2.5表達(dá)下降，7 d后又有所恢復(fù)[8]。體外實(shí)驗(yàn)表明，Nkx2.5基因的表達(dá)可以啟動(dòng)心肌的發(fā)生[9]。心肌梗死后，有Nkx2.5表達(dá)陽性的干細(xì)胞遷移到梗死灶，并且分化為心肌細(xì)胞[10]。這些研究說明心肌中Nkx2.5表達(dá)陽性的干細(xì)胞具有向心肌細(xì)胞分化的潛能。此外，Heineke等[11]研究發(fā)現(xiàn)，在鼠類心臟中特異性高表達(dá)GATA4可以增加心肌毛細(xì)血管和小血管密度，增強(qiáng)冠脈流量儲(chǔ)備和冠脈灌注依賴的心肌收縮力，提示GATA4可調(diào)控冠脈血管生成。GATA4還可以激活p19細(xì)胞的Nkx2.5啟動(dòng)子。Nkx2.5和GATA4可協(xié)同作用誘導(dǎo)心肌分化[12]。

本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在急性心肌梗死后第1天，模型組大鼠GATA4、Nkx2.5mRNA表達(dá)水平均顯著下降，并在10 d后升高，提示心肌梗死可激活GATA4、Nkx2.5表達(dá)，與文獻(xiàn)[8]報(bào)道相符；予以血府逐瘀湯干預(yù)1 d、10 d、15 d后，大鼠心肌組織中的GATA4、Nkx2.5mRNA表達(dá)量均升高，雖然與模型組相比差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，但仍提示血府逐瘀湯可能對(duì)梗死后大鼠的心肌發(fā)育相關(guān)基因GATA4、Nkx2.5表達(dá)具有正性促進(jìn)作用。GATA4、Nkx2.5表達(dá)的增加在促使心臟原始細(xì)胞分化成心肌細(xì)胞及增加心肌毛細(xì)血管和小血管密度、調(diào)控冠脈血管生成中起到一定的作用，提示血府逐瘀湯可能是通過上調(diào)GATA4、Nkx2.5的表達(dá)來促進(jìn)梗死后心肌組織迅速修復(fù)、愈合的。此外，本實(shí)驗(yàn)結(jié)果也提示下一步可能需要通過適當(dāng)延長血府逐瘀湯的干預(yù)時(shí)間或通過擴(kuò)大樣本量來連續(xù)觀察梗死后大鼠心肌發(fā)育相關(guān)基因GATA4、Nkx2.5的表達(dá)趨勢(shì)，以獲得更有意義的實(shí)驗(yàn)結(jié)果，為豐富中醫(yī)“祛瘀生新”的理論內(nèi)涵提供機(jī)制支持。

[參考文獻(xiàn)]

[1]萬雪原，劉桂鸞，王淑芳. 血府逐瘀湯治療急性心肌梗死后心絞痛34例療效觀察[J]. 河北中醫(yī)，2000，28(11)：28-29

[2]高會(huì)麗，李貽奎，仝燕，等. 冠心Ⅱ號(hào)系列方對(duì)大鼠心肌梗死的實(shí)驗(yàn)研究[J]. 陜西中醫(yī)，2008，29(2)：231-233

[3]方居正. 活血化瘀法對(duì)急性心肌梗死病人血清前膠原蛋白Ⅲ的影響[J]. 中國中醫(yī)藥現(xiàn)代遠(yuǎn)程教育，2009，7(7) ：9-10

[4]袁肇凱. 中醫(yī)診斷實(shí)驗(yàn)方法學(xué)[M]. 2版. 北京:科學(xué)技術(shù)出版社，2006：257

[5]汪進(jìn)益，范慧敏，劉中民. 建立適用于細(xì)胞移植研究的大鼠心肌梗死動(dòng)物模型[J]. 上海醫(yī)學(xué)，2007，30(增刊)：63

[6]張金生. 活血化瘀治法理論“祛瘀血”和“生新”層面的內(nèi)涵探究[J]. 北京中醫(yī)藥大學(xué)學(xué)報(bào),2012,35(4):230-232

[7]Linke A,Müller P,Nurzynska D,et al. Stem cells in the dog heart are self-renewing, clonogenic, and multipotent and regenerate infarcted myocardium, improving cardiac function[J]. Proc Natl Acad Sci USA，2005，102(25):8966-8971

[8]姜濤，王春梅，來儀. 大鼠心肌發(fā)育相關(guān)基因在心肌梗死后的表達(dá)變化[J]. 中國生物化學(xué)與分子生物學(xué)報(bào)，2004，20(6) ：833-837

[9]Dai YS，Cserjesi P，Markham BE，et al. The transcription factors GATA4 and dHAND physically interact to synergistically activate cardiac gene expression through a p300-dependent mechanism[J]. J Biol Chem，2006，277(27)：390-398

[10] Takei S,Ichikawa H,Johkura K,et al. Bone morphogenetic protein-4 promotes induction of Cardiomyocytes from human embryonic stem cells in serum-based embryoid body development[J]. Am J Physiol Heart Circ Physiol，2009，296(6)：H1793-H1803

[11] Heineke J，Auger Messier M，Xu J，et al. Cardiomyocyte GATA4 functions as a stress-responsive regulator of angiogenesis in the murine heart[J]. J Clin Invest，2007，117(11) ：3198-3210

[12] 王晶晶，趙瑞慶，李海榮. 轉(zhuǎn)錄因子GATA4與原始心管的形成和靜脈端的發(fā)育[J]. 解剖學(xué)雜志，2009，32(4)：437-441

Regulatory effect of Xuefu Zhuyu decoction on GATA4 and NKx2.5 in rats after myocardial infarction

ZHOU Jing, ZHANG Yan, ZHANG Qian, DENG Zhonglong, ZHU Yanfeng

(Yueyang Hospital of Integrative Chinese & Western Medicine Affiliated to Shanghai University of TCM, Shanghai 200437, China)

Abstract:Objective It is to explore the regulatory effect of Xuefu Zhuyu decoction on gene GATA4 and NKx2.5 in rats after myocardial infarction. Methods The left anterior descending coronary arteries of SD rats were ligated to establish rat models of myocardial infarction. All rats with myocardial infarction were divided into model group (n=30) and Xuefu Zhuyu decoction group (n=30).Anther 10 rats were selected as sham group (n=10).The rats in control group were treated with 2mL of 0.9% NaCl per day. The rats in Xuefu Zhuyu decoction group were treated with 2 mL of concentrated decoction per day. Treatment duration was also altered. There were three different duration of treatments specifically 1 day, 10 days, and 15 days. The levels of GATA4, Nkx2.5mRNA in myocardium were detected by RT-PCR. Results On the 1st day after myocardial infarction, the expression of GATA4mRNA and Nkx2.5mRNA in myocardial infarction model group were significantly decreased compared to those in the sham group (P<0.05). On the 10th day after myocardial infarction,the expression of GATA4mRNA and Nkx2.5mRNA in model group and Xuefu Zhuyu decoction group were not significantly increased compared to those in the sham group (P>0.05), but the expression of GATA4mRNA and Nkx2.5mRNA in model group and the expression of GATA4mRNA in Xuefu Zhuyu decoction group on the 10th day were significantly increased compared to those in the sham group on the 1st day (P<0.05). On the 15th day after myocardial infarction,the expression of GATA4mRNA and Nkx2.5mRNA in Xuefu Zhuyu decoction group were significantly increased compared to those in the sham group (P<0.05). On the 1st, 10th and 15th day after myocardial infarction, the expression of GATA4mRNA and Nkx2.5mRNA in Xuefu Zhuyu decoction group were increased compared to those in the myocardial infarction model group, but there was not significant difference between the two groups(P>0.05).Conclusion Xuefu Zhuyu decoction may have a regulatory effect on gene GATA4 and NKx2.5 in rats after myocardial infarction and this effect may be one of the genetic basis of accelerated myocardial cell repair.

Key words:Xuefu Zhuyu decoction; myocardial infarction; GATA4; Nkx2.5

[收稿日期]2016-01-05

[中圖分類號(hào)]R-332

[文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼]A

[文章編號(hào)]1008-8849(2016)14-1486-03

doi:10.3969/j.issn.1008-8849.2016.14.002

[基金項(xiàng)目]國家自然科學(xué)基金(青年基金)資助項(xiàng)目(81202668)

[作者簡介]周菁，女，中醫(yī)學(xué)博士，主治醫(yī)師，主要從事中西醫(yī)結(jié)合防治冠心病的研究。