不同培養基組分對帶葉兜蘭離體培養效果的影響

陳寶玲 陳爾 楊舒婷 王華新 龔建英 蘇莉花

摘要：【目的】探討適宜帶葉兜蘭（Paphiopedilum hirsutissimum）離體培養的培養基組分，為規模化生產帶葉兜蘭組培苗提供技術支持。【方法】以帶葉兜蘭組培苗為外植體，篩選適合其叢生芽誘導、增殖和壯苗生長的基本培養基、附加物種類和生長激素組合。【結果】初步篩選出較適宜帶葉兜蘭叢生芽誘導的培養基為1/2MS+3.0 mg/L BA+0.1 mg/L NAA+80.0 g/L香蕉汁+2.0 g/L活性炭，其誘導率較高，為36.1%，且叢生芽誘導出芽較多；叢生芽增殖培養基為1/2MS+0.1 mg/L TDZ+3.0 mg/L 2，4-D+80.0 g/L香蕉汁+2.0 g/L活性炭，其增殖系數為2.02，芽生長較快；壯苗生長最適宜培養基為1.0 g/L花寶1號+1.0 g/L花寶2號+MS培養基的有機、微量成分+1.0 mg/L NAA+2.0 g/L活性炭+80.0 g/L香蕉汁+1.5 g/L蛋白胨，其幼苗生長較好，生物量大，生根率達75.5%。【結論】在1/2MS+3.0 mg/L 6-BA+0.1 mg/L NAA+2.0 g/L活性炭培養基中添加香蕉汁較適宜帶葉兜蘭叢生芽誘導和增殖培養；在1/2MS+80.0 g/L香蕉汁培養基中添加0.1 mg/L TDZ+3.0 mg/L 2，4-D對帶葉兜蘭的增殖效果較佳；花寶改良培養基適宜帶葉兜蘭壯苗培養，結合添加NAA和活性炭培養效果更佳，但活性炭濃度不宜過高。

關鍵詞： 帶葉兜蘭；離體培養；培養基組分；基本培養基

中圖分類號： S682.31 文獻標志碼：A 文章編號：2095-1191（2016）10-1730-07

0 引言

【研究意義】兜蘭屬（Paphiopedilum）又稱為拖鞋蘭、仙履蘭，是蘭科植物中瀕危程度最高的種群。由于野生種群小、個體數量少、分布區域有限，兜蘭屬所有種均被列入野生動植物瀕危物種國際貿易公約（CITES）附錄I的保護范圍（羅毅波等，2003）。兜蘭是最具觀賞價值的蘭花類群之一，帶葉兜蘭（P. hirsutissimum）是兜蘭屬栽培適應性較好的原生種類，花色莊重素雅，花形奇特，市場需求量大。然而，自然條件下兜蘭的繁殖力極弱，成苗緩慢。因此，利用離體快繁技術解決帶葉兜蘭資源保護與開發利用的矛盾，對帶葉兜蘭新品種選育及優良兜蘭品種的商品化生產具有重要意義。【前人研究進展】近年來，針對兜蘭的研究主要集中在生態學（劉仲健等，2006）、遺傳學、雜交育種、傳粉生物學（史軍等，2007）、無菌播種（曾宋君等，2007；張娟娟等，2013）、引種栽培及菌根真菌（孫曉穎，2014）等方面，并取得了一定的進展。陳之林等（2004）研究發現，低鹽濃度培養基添加椰子汁可促進杏黃兜蘭（P. armeniacum）和硬葉兜蘭（P. micranthum）種子萌發，育苗培養基中添加活性炭和香蕉汁有利于其種子苗生長。丁長春等（2004）研究認為，杏黃兜蘭種子在低鹽濃度的1/5MS中萌發效果最佳，且添加椰子汁可促進其萌發，添加香蕉汁則抑制其萌發，添加活性炭（2.0 g/L）能促使其萌發和幼苗發育。曾宋君等（2006）研究帶葉兜蘭離體快繁技術，結果表明，RE和花寶是較好的培養基，增殖過程中添加活性炭可防止玻璃化苗，添加香蕉汁有利于壯苗生根培養。曾宋君等（2006）、丁長春和夏念和（2009）還開展了亨利兜蘭（P. henryanum）、彩云兜蘭（P. wardii）、麻栗坡兜蘭（P. malipoense）等十多種兜蘭的無菌培養技術研究，為國內兜蘭組培技術的早期探索打下了基礎。此外，田凡等（2014）、尤佳妍等（2014）對兜蘭組培技術進行了深入研究。【本研究切入點】目前，帶葉兜蘭組織培養的培養基尚存在增殖率和移栽成活率不高等問題，而有關增加帶葉兜蘭的繁殖系數及培育壯苗方面的研究鮮見報道。【擬解決的關鍵問題】探討不同基本培養基、添加物種類和生長激素組合對帶葉兜蘭組培苗叢生芽誘導、增殖和幼苗生長的影響，篩選適合其誘導、增殖及壯苗生根的培養基組分，為規模化生產帶葉兜蘭組培苗提供技術支持。

1 材料與方法

1. 1 試驗材料

帶葉兜蘭蒴果采自廣西河池天峨龍灘自然保護區。將帶葉兜蘭蒴果清洗干凈，去除表面絨毛后用75%乙醇消毒1 min，5%次氯酸鈉消毒15 min，無菌水沖洗4次，剖開種皮后取出種子播種在花寶1號+1.0 g/L NH4NO3培養基上（圖1-a），暗培養30 d后于25 ℃、光照強度2000 lx環境下培養60 d，然后選擇生長健康、長勢一致的無菌幼苗作為試驗材料。

1. 2 試驗方法

1. 2. 1 叢生芽誘導和增殖培養 取具2～3片葉且無根或極少根的兜蘭小植株，以RE、花寶（1.5 g/L花寶1號+1.5 g/L花寶2號）、1/2MS及MS等4種培養基為基本培養基，添加不同濃度的植物生長調節劑和有機物，進行帶葉兜蘭叢生芽誘導及增殖培養的培養基篩選；以篩選出適宜兜蘭叢生芽誘導的1/2MS培養基為基本培養基，設添加椰子汁（150.0 mL/L）和香蕉汁（100.0 g/L）兩種添加物處理，以不添加附加物為對照（CK1），并設添加0.1 mg/L NAA配合0、1.5和3.0 mg/L 6-BA 3種濃度處理，篩選適宜叢生芽誘導的添加物和激素濃度。增殖階段培養基采用適宜叢生芽誘導的1/2MS培養基，添加80.0 g/L香蕉汁，進一步通過添加不同種類和濃度植物激素，對叢生芽增殖情況進行比較，以不添加激素為對照（CK2），具體配方見表4。每處理15瓶，3次重復，誘導試驗每瓶3株，90 d后以瓶為單位統計誘導率、增殖系數、黃化率、成活率和植株生長情況；增殖試驗每瓶5叢，每叢2株，90 d后以瓶為單位統計增殖系數、芽株高和植株生長情況。誘導率、增殖系數、黃化率、成活率參考秦麗鳳和石貴玉（2013）、葉維雁等（2015）、祝劍峰等（2015）的方法進行計算。

誘導率（%）=萌芽株數/接種總株數×100

增殖系數=增殖的新芽數/每瓶接入芽數

黃化率（%）=黃化株數/接種總株數×100

成活率（%）=成活株數/接種總株數×100

1. 2. 2 壯苗及生根培養 取具2～3片葉、2～3條根的兜蘭植株，以RE、花寶（1.0 g/L花寶1號+1.0 g/L花寶2號）、花寶改良（1.0 g/L花寶1號+1.0 g/L花寶2號+MS培養基的有機、微量成分）、MS等4種培養基為基本培養基，分別添加1.0 mg/L NAA、0.1 mg/L 6-BA、2.0 g/L活性炭，篩選適宜兜蘭壯苗和生根的基本培養基；以花寶改良為基本培養基，附加2.0 g/L活性炭，添加NAA和6-BA兩種生長激素，篩選適宜壯苗生長的激素組合；以花寶改良為基本培養基，附加0、2.0和4.0 g/L活性炭，篩選適宜壯苗生長的活性炭濃度。每處理15瓶，每瓶3株，3次重復。90 d后以瓶為單位統計植株鮮重、葉長、葉寬、根系長度、新根數及生根率等生長指標。

生根率（%）=生根株數/接種總株數×100

1. 2. 3 培養條件 上述增殖培養基均添加4.8 g/L瓊脂、20.0 g/L蔗糖；壯苗及生根培養基均添加5.0 g/L瓊脂、30.0 g/L蔗糖、1.5 g/L蛋白胨、80.0 g/L香蕉汁；pH 5.8。培養條件為25 ℃，每天光照12 h，光照強度2000 lx，培養周期為90 d。其中，增殖期間先暗培養30 d，再轉為光照培養。

1. 3 統計分析

試驗數據利用Excel 2003和DPS 7.05進行統計分析。

2 結果與分析

2. 1 兜蘭叢生芽的誘導和增殖

2. 1. 1 不同基本培養基對帶葉兜蘭叢生芽誘導的影響

由表1可知，不同基本培養基對帶葉兜蘭叢生芽誘導率存在差異，但整體誘導率不高，增殖系數較小。其中，在添加1.5 mg/L 6-BA+0.1 mg/L NAA和2.0 g/L活性炭的4種基本培養基上，以1/2MS培養基的芽誘導率最高，為15.2%，花寶培養基的最低，為6.7%，二者間差異極顯著（P<0.01，下同），且前者的叢生芽萌發最早，接種后20 d即出現芽萌動，芽長勢旺盛，無黃化、變異及死亡等不良生長現象，后者植株的死亡率最高，達12.5%，與前者差異極顯著。RE培養基誘導的叢生芽黃化率達15.1%，并伴少量植株死亡，MS培養基誘導的叢生芽植株也有死亡現象。說明1/2MS+1.5 mg/L 6-BA+0.1 mg/L NAA+2.0 g/L活性炭較適合作為帶葉兜蘭叢生芽誘導的培養基。

2. 1. 2 不同天然添加物對帶葉兜蘭叢生芽誘導的影響

由表2可知，在1/2MS+1.5 mg/L 6-BA+0.1 mg/L NAA+ 2.0 g/L活性炭基礎上添加椰子汁的培養基中帶葉兜蘭叢生芽誘導率較高，為22.1%，與添加香蕉汁的誘導率（20.5%）差異顯著（P<0.05，下同），植株鮮綠，偶見黃化和芽死亡，而添加香蕉汁培養基中芽的增殖系數較大，達1.34，極顯著大于添加椰子汁的培養基及CK1，植株無黃化現象，但植株會偶發變異。叢生芽誘導出芽成活率以添加香蕉汁的培養基較高，但與添加椰子汁培養基及CK1的差異不顯著（P>0.05，下同）。因此，1/2MS+ 1.5 mg/L 6-BA+0.1 mg/L NAA+2.0 g/L活性炭+80.0 mL/L香蕉汁適宜作為帶葉兜蘭叢生芽誘導的培養基。

2. 1. 3 不同濃度6-BA對帶葉兜蘭叢生芽誘導的影響

由表3可知，在添加0.1 mg/L NAA的條件下，隨著6-BA用量的增加，帶葉兜蘭叢生芽的誘導效果得到明顯改善。其中，添加3.0 mg/L 6-BA的培養基帶葉兜蘭叢生芽誘導率為36.1%，極顯著高于添加0～1.5 mg/L 6-BA的培養基；增殖系數為1.47，比添加0～1.5 mg/L 6-BA的培養基提高了42.7%和21.5%，且無植株黃化，該培養基上誘導的叢生芽成活率高，生長旺盛，葉片油綠（圖1-b）。說明可將2.1.2中適宜帶葉兜蘭叢生芽誘導的培養基1/2MS+1.5 mg/L 6-BA+0.1 mg/L NAA+2.0 g/L活性炭+80.0 mL/L香蕉汁調整為1/2MS+3.0 mg/L 6-BA+0.1 mg/L NAA+2.0 g/L活性炭+80.0 mL/L香蕉汁。

2. 1. 4 不同激素組合對帶葉兜蘭叢生芽增殖的影響

為擴大誘導獲得的叢生芽數量，在增殖培養中進一步調整激素種類和用量以篩選最佳增殖培養基組分。由表4可知，在1/2MS培養基中添加不同激素種類和用量的帶葉兜蘭叢生芽增殖系數差異不顯著，其中，添加TDZ和2，4-D處理的增殖系數較大，其次是添加NAA和6-BA處理，但叢生芽偶見變異，添加KT處理的增殖系數較小。在添加TDZ和2，4-D的處理中，以添加0.1 mg/L TDZ+3.0 mg/L 2，4-D為最適的帶葉兜蘭叢生芽增殖激素組合，無植株死亡，增殖系數達2.02，平均芽株高1.83 cm，極顯著高于除3.0 mg/L 6-BA+0.2 mg/L NAA外的其他處理；TDZ濃度增加至0.3 mg/L或2，4-D濃度減少至1.0 mg/L均會極顯著抑制新芽的生長發育；添加0.1 mg/L TDZ+1.0 mg/L 2，4-D處理的增殖系數達1.92，平均芽株高1.63 cm，極顯著高于CK2，新芽葉油綠、長勢較好，仍可用于進行帶葉兜蘭叢生芽增殖；添加5.0 mg/L 6-BA+0.5 mg/L NAA處理的增殖系數為1.83，也可用于帶葉兜蘭叢生芽增殖，但芽株高較矮，為1.43 cm；添加3.0 mg/L 6-BA+0.2 mg/L NAA處理的增殖系數為1.53，但芽生長較好，株高（1.73 cm）顯著高于CK2，亦可用于帶葉兜蘭叢生芽增殖。添加KT處理的叢生芽增殖系數小，尤其是添加1.0 mg/L KT處理，芽極矮小，生長較弱，不宜用于帶葉兜蘭叢生芽增殖。

2. 2 兜蘭叢生芽增殖苗的壯苗和生根培養

2. 2. 1 不同基本培養基對帶葉兜蘭增殖苗壯苗和生根的影響 由表5可知，在添加1.0 mg/L NAA、0.1 mg/L 6-BA及80.0 g/L香蕉汁的4種基本培養基上，帶葉兜蘭增殖苗均能正常生長，培養到120 d時，4種基本培養基上增殖苗的鮮重間及葉片長度間差異不顯著；增殖苗在花寶改良培養基上生長效果最佳，植株葉片寬展，濃綠有光澤，根系發達，新根萌發多且長，生根率達75.5%，極顯著高于其他處理，新根萌發數分別比MS、RE和花寶培養基提高94.3%、54.5%和61.9%，差異顯著；根系長度比RE、花寶及MS培養基分別提高197.4%、175.6%和264.5%，且差異極顯著。此外，花寶改良培養基的葉片寬比花寶培養基提高20.0%，差異顯著。在RE和MS培養基上，帶葉兜蘭葉片失綠較明顯，葉色暗淡，尤其是在MS培養基上，葉片出現白化現象較多，且葉細長，生根率僅58.1%，極顯著低于RE和花寶改良培養基，顯著低于花寶培養基。

可見，花寶改良培養基有利于兜蘭幼苗葉幅增大、新根萌發和伸長，促進幼苗地上部分和地下部分協同增長，花寶、RE和MS培養基增殖苗的生長情況依次變差，說明低鹽培養基更適合于帶葉兜蘭的壯苗培養，豐富的微量和有機元素能有效促進兜蘭組培苗對營養物質的吸收和生物量的積累（圖1-c）。

2. 2. 2 不同生長激素對帶葉兜蘭幼苗壯苗和生根的影響 由表6可知，在添加了香蕉汁和活性炭的花寶改良培養基上，添加生長激素NAA和6-BA對帶葉兜蘭幼苗的生物量、葉片寬度和生根率均有一定的提高作用。其中，添加1.0 mg/L NAA培養基中幼苗的長勢最佳，主要表現在鮮重增加明顯、葉片寬大平展及根系粗壯等方面，尤其是鮮重和葉片寬度顯著或極顯著高于不添加NAA或添加NAA+6-BA的培養基。在生根率方面，添加NAA的培養基比不添加NAA的培養基提高35.2%，差異顯著，與添加NAA+6-BA的培養基差異不顯著。因此，添加1.0 mg/L NAA能較好地促進帶葉兜蘭幼苗生長，但結合0.1 mg/L 6-BA使用后，兜蘭地上部分生長量較小，說明6-BA在一定程度上弱化了NAA促進兜蘭生長的作用。

2. 2. 3 不同濃度活性炭對帶葉兜蘭壯苗和生根的影響 由表7可知，在花寶改良培養基中添加活性炭可促進帶葉兜蘭組培苗生根，促進根的生長和新根的分化，且對幼苗的生物量積累和葉面積增大產生了良好的促進作用，其中，以添加2.0 g/L活性炭幼苗的長勢較佳，鮮重比不添加活性炭及添加4.0 g/L活性炭分別提高62.5%和30.0%，差異達極顯著或顯著水平；葉片長度比不添加活性炭及添加4.0 g/L活性炭分別提高24.1%和16.0%，差異均達極顯著或顯著水平；根系長度比不添加活性炭及添加4.0 g/L活性炭分別提高117.6%和37.0%，差異極顯著或顯著；生根率比不添加活性炭提高74.4%，差異極顯著，但與添加4.0 g/L活性炭差異不顯著。說明活性炭不僅為根的生長提供了較好的暗環境，還能吸附一部分幼苗生長過程中產生的代謝物和有毒物質。因此，添加2.0 g/L活性炭的培養基較適宜帶葉兜蘭壯苗生長，組培苗移栽后較易成活（圖1-d）。

3 討論

帶葉兜蘭是介于附生與地生間的蘭科植物，離體培養過程中試管苗發育較緩慢，一定時間內的繁育數量受限，移栽難度較大，通過組織培養方法進行其叢生芽增殖和培育壯苗是快速擴大組培苗數量和促進組培苗移栽成活的重要措施。兜蘭的試管成苗過程受兜蘭種類、外植體種類、光照時間、培養基種類、有機添加物類型等條件影響（Pierik et al.，1988；Zeng et al.，2011，2012）。本研究結果表明，1/2MS培養基對帶葉兜蘭的增殖效果較佳，叢生芽萌動早，新芽質量好且生長量大，而其他培養基會出現芽死亡或黃化現象，說明降低培養基的無機鹽濃度有利于兜蘭叢生芽的誘導，與楊燕萍等（2011）對亨利兜蘭的研究結果相似。李慧敏等（2013）研究發現，培養基中天然有機添加物含有氨基酸、激素、酶等多種復雜成分，能促進白芨組培苗的增殖分化和生長，本研究結果與其相似，添加適量香蕉汁可有效提高兜蘭的叢生芽增殖率。本研究發現，培養基中添加3.0 mg/L 6-BA+0.1 mg/L NAA對兜蘭叢生芽誘導有較好的促進作用，叢生芽生長旺盛，無死亡或變異，增殖培養以添加0.1 mg/L TDZ+3.0 mg/L 2，4-D的效果較好，無植株死亡，芽生長量大，但兜蘭叢生芽的增殖系數整體偏小，最大的僅2.02，明顯小于丁長春和夏念和（2009）對麻栗坡兜蘭、楊燕萍等（2011）對亨利兜蘭叢生芽的增殖系數，其原因除了與所使用的兜蘭種類、激素濃度和配比不同有關外，還可能與本研究使用的材料數量有限、尤其是誘導階段每瓶內接種植株數量較少且為單植（帶葉兜蘭是群居性蘭花）有關。本研究增殖培養中添加TDZ和2，4-D培養基雖可增殖叢生芽數量，但增殖系數增加有限，未產生多芽叢植的群聚效應。崔秋華等（2012）對齒瓣石斛叢生芽增殖的研究也認為，隨著叢植芽數量的增多，增殖系數逐漸提高，5株一叢時有利于芽的增殖和生長。

組培苗生長健壯有利于移栽后縮短緩苗時間，提高其對外界環境的適應能力和抵抗能力。已有的研究表明，低鹽濃度培養基適合多數兜蘭組培苗的生長發育，高鹽濃度培養基則抑制其幼苗的生長，但不同兜蘭種類有其最適宜的培養基類型，如帶葉兜蘭（曾宋君等，2006）、麻栗坡兜蘭（丁長春和夏念和，2009）和亨利兜蘭（楊燕萍等，2011）等在花寶培養基上的壯苗生根效果較好，而報春兜蘭適合在RE培養基中培育壯苗（周麗等，2013），小葉兜蘭在1/2MS培養基上生長旺盛（尤佳妍等，2014）。本研究中使用的花寶改良培養基含鹽量低，氮、磷、鉀比例更適合培育帶葉兜蘭壯苗的需求，配合MS培養基中的有機及微量元素成分使用，兜蘭植株葉幅增大，根系發達，能明顯促進組培苗出瓶移栽成活。本研究采用NAA 1.0 mg/L即可較好地促進帶葉兜蘭幼苗生長，與丁長春和夏念和（2009）對多種兜蘭、周麗等（2013）對報春兜蘭、田凡等（2014）對白花兜蘭、尤佳妍等（2014）對小葉兜蘭的壯苗和生根研究結果相似。

活性炭具有強大的吸附能力，可吸附培養物在代謝過程中產生的有害物質，同時有利于根的向地性生長，在兜蘭種子苗培養過程中還可防止酚污染和變褐老化，促進器官形成，減少玻璃化（陳宇勒，2009）。陳爾等（2014）和田凡等（2014）研究認為適量的活性炭對春蘭及白花兜蘭根的生長發育有重要作用。本研究設3個濃度活性炭添加量處理，結果發現以添加2.0 g/L的壯苗和生根效果最好，與曾宋君等（2006）、尤佳妍等（2014）的研究結果一致。

4 結論

在1/2MS+3.0 mg/L 6-BA+0.1 mg/L NAA+2.0 g/L活性炭培養基中添加香蕉汁較適宜帶葉兜蘭叢生芽誘導和增殖培養；在1/2MS+80.0 g/L香蕉汁培養基中添加0.1 mg/L TDZ+3.0 mg/L 2，4-D有助于提高帶葉兜蘭的增殖系數；花寶改良培養基適宜帶葉兜蘭壯苗培養，結合添加NAA和活性炭使用，生根效果更佳，但活性炭濃度不易過高。

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（責任編輯 思利華）