廣西甜瓜細菌性果斑病病原鑒定及16S rDNA序列分析

謝慧婷 李戰彪 秦碧霞 楊世安 崔麗賢 鄧鐵軍 蔡健和

摘要：【目的】對廣西區內疑似甜瓜細菌性果斑病的病原菌進行分離鑒定，明確引起該病害的病原菌，為甜瓜細菌性果斑病的抗病育種及綜合防治提供理論依據。【方法】分別采集南寧市和賀州市疑似甜瓜細菌性果斑病的病葉（編號：WM0922）和病果（編號：XD0611）樣品，對樣品進行分離純化，并通過測定分離菌株的致病性、觀察菌落形態和培養性狀、測定其生理生化性狀及比對分析16S rDNA序列，對供試病原菌進行鑒定。【結果】從編號WM0922的病葉上分離得到5株菌株，經致病性測定有3株菌株（WM0922-2、WM0922-3和WM0922-4）具有致病性；從編號XD0611的病果上分離得到8株菌株，經致病性測定有4株菌株（XD0611-5、XD0611-6、XD0611-7和XD0611-8）具有致病性；擇優選取具有代表性的菌株WM0922-3和XD0611-7進行后續試驗，發現二者均可侵染葫蘆子葉，革蘭氏反應均為陰性，培養性狀及生理生化測定結果一致，對比分析16S rDNA基因序列，與Acidororax citrulli的相似性均在99%以上。【結論】引起甜瓜細菌性果斑病的病原菌為燕麥嗜酸菌西瓜亞種（A. avenae subsp. citrulli）。

關鍵詞： 甜瓜；果斑病菌；病原菌鑒定；燕麥嗜酸菌西瓜亞種

中圖分類號： S432.1 文獻標志碼：A 文章編號：2095-1191（2016）10-1698-06

0 引言

【研究意義】廣西常年西甜瓜種植面積約6萬ha，主要集中在南寧市、北海市、桂林市及桂東南和桂中的部分地區（洪日新等，2009）。近年來，隨著廣西甜瓜產業的迅猛發展，甜瓜病蟲害也日益嚴重。2015年，在廣西甜瓜種植區發現一種疑似國內檢疫性病害——甜瓜細菌性果斑病，該病害早期可為害甜瓜葉片和莖稈，引起水漬狀病斑，后干枯壞死；后期為害果實，引起果肉腐爛變質，個別大棚的發病率達100%，果農損失慘重。因此，對疑似甜瓜細菌性果斑病病原菌進行鑒定，明確引起該病害的病原菌，進而采取有針對性的防治措施，對保障廣西甜瓜產業的健康發展具有重要意義。【前人研究進展】瓜類細菌性果斑病病害最早于1969年在美國佛羅里達州的西瓜上發現，1989年在美國大陸嚴重暴發（Crall and Schenck，1969；Hopkins，1989）；1998年我國首次在西瓜上發現西瓜細菌性果斑病（張榮意等，1998）。1978年Schaad等首次將西瓜細菌性果斑病鑒定為Psendomonas psendomonas subsp. citrulli；1992年Willems等采用rRNA-DNA和DNA- DNA將西瓜細菌性果斑病病原菌更名為Acidororax avenae subsp. citrulli。我國對甜瓜細菌性果斑病病原菌鑒定的研究也較多。趙廷昌等（2001）采用柯赫氏法則、革蘭氏染色反應、生理生化反應、細胞化學成分分析和DNA-DNA雜交的方法將內蒙古、新疆的甜瓜細菌性果斑病鑒定為A. citrulli。王曉東等（2010）采集武漢地區的甜瓜病樣進行分離純化，并采用致病性測定、形態學、培養性狀、生理生化性狀和16S rRNA序列分析等方法，將武漢地區的甜瓜細菌性果斑病鑒定為A. citrulli。吉訓聰等（2012）采集海南甜瓜病樣進行分離鑒定純化，并采用柯赫氏法則對分離菌株進行致病性測定及形態學、培養性狀、生理生化性狀和16S rRNA序列等方法，將海南的甜瓜細菌性果斑病鑒定為A. citrulli。朱曉媛等（2013）從云南滇南地區采集疑似細菌性果斑病的西瓜、甜瓜樣品，對其進行分離鑒定，觀察分離菌的培養性狀，分析其ITS序列，最終確定云南瓜類細菌性果斑病的病原菌為A. citrulli。【本研究切入點】雖然國內外對瓜類細菌性果斑病的研究較多，但未發現有對廣西甜瓜細菌性果斑病病原菌鑒定的相關報道。【擬解決的關鍵問題】采用傳統的細菌鑒定方法和現代分子生物學技術，對引起廣西甜瓜細菌性果斑病的病原菌進行鑒定、分析，明確引起該病害的病原菌，以期為甜瓜細菌性果斑病的抗病育種及綜合防治提供理論依據。

1 材料與方法

1. 1 試驗材料

1. 1. 1 樣品 2014年9月從南寧市武鳴縣采集厚皮甜瓜（北甜一號甜瓜）植株上疑似細菌性果斑病的病葉，編號：WM0922；2015年6月從賀州市信都鎮祉洞村采集薄皮甜瓜（廣州白沙蜜甜瓜）疑似細菌性果斑病的病果，編號：XD0611；陽性對照菌株由中國農業科學院鄭州果樹研究所古勤生老師課題組提供，編號：B+。

1. 1. 2 試劑 細菌基因組DNA提取試劑盒及2×Taq Master Mix均購自北京康為世紀生物科技有限公司，其余試劑均為國產分析純。

1. 2 試驗方法

1. 2. 1 病原菌分離 參照方中達（1998）的方法，選取疑似甜瓜細菌性果斑病的病瓜和病葉，切取病健交界部位的組織，75%酒精消毒20 s，移至5%次氯酸鈉溶液消毒1 min，滅菌水沖洗3次，置于滅菌研缽中研磨，加無菌水浸泡20 min，然后在YDC培養基上劃線接種，28 ℃培養48 h，選取單菌落進行純化培養。

1. 2. 2 病原菌致病性測定 將分離獲得的菌株分別接種于LB培養液中，28 ℃培養36 h后制成1×108 CFU/mL菌懸液。

厚皮甜瓜葉片上的致病性測定：選取健康厚皮甜瓜種子120粒，每20粒種子為1組，浸泡于不同編號的菌懸液中30 min，以無菌水為對照，分別水洗后每組中的20粒種子分成3份種植于穴盤中，常規管理。

薄皮甜瓜果實上的致病性測定：選取健康薄皮甜瓜，75%酒精擦拭果皮表面后用接種針蘸取菌懸液分別針刺于果皮表面，28 ℃保濕培養48 h，觀察結果。

根據甜瓜葉片和果實上的致病性測定結果，測試獲得供試菌株對葫蘆苗的致病性：選取健康安生葫蘆種子100粒，正常催芽后每20粒種子為1組，浸泡于不同編號的菌懸液中30 min，以無菌水為對照，分別水洗后種植于穴盤中，常規管理。

1. 2. 3 病原菌形態觀察 將分離純化后獲得的菌株分別接種于LA培養基上，于28 ℃恒溫箱中培養48 h后，觀察菌落形態、質地、大小、透明度及表面光滑程度等培養性狀。

1. 2. 4 病原菌生理生化性狀測定 參考方中達（1998）、趙廷昌（2011）的方法。測定所用新鮮菌株均在NA培養基上培養24 h，每個測定重復3次。

1. 2. 5 馬鈴薯軟化試驗 參照趙廷昌等（2001）的方法，先將馬鈴薯切成片狀，再將NA培養基上培養24 h的新鮮菌株用移菌環接種到片狀馬鈴薯的切面，保濕后置于28 ℃恒溫箱中，每天觀察記錄馬鈴薯腐敗情況。

1. 2. 6 病原菌16S rDNA序列分析 細菌DNA的提取：參考試劑盒提供的方法進行DNA提取，獲得的DNA溶液置于-20 ℃冰箱中保存備用。

PCR擴增：以細菌總DNA為模板，采用細菌16S rDNA的通用引物27F/1492R進行擴增（27F：5'-AGAG

TTTGATCCTGGCTCAG-3'；1429R：5'-GGTTACCTT

GTTACGACTT-3'，片段長1400 bp）。引物由英濰捷基（上海）貿易有限公司合成。

PCR反應體系（10.0 μL）：2×Taq MasterMix 5.0 μL，引物27F（10 μmol/L）和1492R（10 μmol/L）各0.5 μL，菌體DNA模板0.5 μL，雙蒸水3.5 μL。擴增程序：95 ℃預變性5 min；95 ℃ 30 s，58 ℃ 30 s，72 ℃ 45 s，進行30個循環；72 ℃延伸10 min，4 ℃下保存。

電泳檢測PCR產物，將未純化的PCR產物送英濰捷基（上海）貿易有限公司進行測序，測序結果通過BLAST程序與GenBank核酸數據庫進行比對分析。

2 結果與分析

2. 1 病害田間癥狀

從南寧市武鳴縣采集的厚皮甜瓜病葉（WM0922）發病癥狀：病葉發病初期有水浸狀小斑點，擴大時有的受葉脈限制成多角形暗綠色病斑，有的沿葉脈發展成條形水漬狀黃褐色病斑，隨后變為褐色，干枯下陷，周圍有黃色暈圈（圖1）。

賀州市信都鎮采集的薄皮甜瓜病瓜（XD0611）發病癥狀：發病初期在病果皮上出現圓形暗綠色水漬狀斑點，后擴展為不規則形褐色水漬狀病斑，病斑輕微凹陷，果皮變薄，一碰即裂，內部果肉變成水浸狀腐爛（圖2）。

2. 2 病原菌鑒定

2. 2. 1 病原菌分離結果 從編號WM0922的病葉上分離得到5株菌株，分別編號WM0922-1～WM0922-5；從編號XD0611的病果上分離得到8株菌株，分別編號XD0611-1～XD0611-8。分離得到的菌株分別接種于健康厚皮甜瓜葉片和健康薄皮甜瓜果皮上。

2. 2. 2 致病性測定結果 接種菌株WM0922-2、WM0922-3和WM0922-4的厚皮甜瓜子葉張開時均出現癥狀，且發病率在98%以上；接種菌株WM0922-1和WM0922-5的厚皮甜瓜植株均未表現癥狀。發病初期厚皮甜瓜子葉葉尖或葉緣出現水漬狀病斑，四周有黃色暈圈，隨后向子葉基部擴展成條形或不規則形水浸狀病斑，病斑擴展至嫩莖時引起嫩莖腐爛，幼苗很快死亡（圖3-A）。對發病后的厚皮甜瓜子葉進行分離純化，得到與供試菌株形態特征相同的菌株。

接種菌株XD0611-5～XD0611-8的薄皮甜瓜果皮48 h后均出現癥狀；接種菌株XD0611-1～XD0611-4的薄皮甜瓜果皮均未表現癥狀。發病初期果皮表面針孔處出現水漬狀病斑（圖3-B），隨后病斑相連擴展，切開發病部位果皮可見果肉已腐爛，并伴有惡臭味。將發病后的果皮進行分離純化，得到與供試菌株形態特征相同的菌株。

擇優選取具有代表性的菌株WM0922-3和XD0611-7進行后續試驗。供試菌株WM0922-3和XD0611-7及對照菌株B+對葫蘆苗的致病性測定結果顯示，供試菌株和對照菌株均在葫蘆子葉張開時即出現癥狀，且發病率在95%以上。發病初期葫蘆子葉葉尖或葉緣上出現水漬狀區域，隨后向子葉基部擴展成條形或不規則形水浸狀病斑，子葉病斑擴展至嫩莖時引起嫩莖腐爛，幼苗很快死亡；子葉病斑逐漸擴大，四周有黃色暈圈，后干枯呈灰褐色壞死斑（圖4）。將發病后的葫蘆子葉進行分離純化，得到與供試菌株形態特征相同的菌株。

2. 2. 3 菌株培養性狀 2株供試菌株在LA培養基上置于28 ℃培養48 h，菌株呈乳白色、半透明狀、圓形、表面光滑、隆起，直徑1～2 mm；在YDC培養基上菌落呈白色。革蘭氏染色反應均為陰性。

2. 2. 4 生理生化特性 供試菌株WM0922-3、XD0611-7和陽性對照B+的生理生化測定結果（表1）相同，其中測定結果表現為陽性的項目有：過氧化氫酶、氧化酶、檸檬酸鈉鹽、明膠液化、淀粉水解、3%氯化鈉溶液、硝酸鹽還原和亞硝酸鹽還原；測定結果表現為陰性的項目有：KB產熒光、5%氯化鈉溶液、吲哚的產生、甲基紅試驗、丙二酸鈉鹽和V-P試驗。

2. 2. 5 馬鈴薯軟化情況 供試菌株WM0922-3和XD0611-7及陽性對照B+均能引起馬鈴薯薯塊軟化腐爛。

2. 2. 6 16S rDNA序列分析 對供試菌株WM0922-3和XD0611-7的16S rDNA序列進行擴增及序列測定分析，獲得2株供試菌株的16S rDNA片段長度分別為1369和1368 bp（GenBank登錄號分別為KU758900和KU865320）。將供試菌株的16S rDNA序列用BLAST在GenBank中進行同源性比對，結果發現，供試菌株WM0922-3和XD0611-7與A. citrulli各菌株16S rDNA的相似性均在99%以上。為進一步了解該菌株的進化情況，以Xanthomonas campestris和Burkholderia humi為外群，用MEGA 5.2的Neighbor-Joining法構建系統發育進化樹（圖5）。從圖5可以看出，供試菌株XD0611-7與海南地區A. citrulli（JQ901493.1）處于同一分支；菌株WM0922-3與鄭州地區A. citrulli（KJ210349.1）和北京地區A. citrulli（KJ210354.1）處于同一分支，說明XD0611-7與A. citrulli（JQ901493.1）可能具有較近的親緣關系，而WM0922-3與A. citrulli（KJ210349.1、KJ210354.1）具有較近的親緣關系。序列分析及系統發育進化樹分析結果均表明，供試菌株WM0922-3和XD0611-7均為燕麥嗜酸菌西瓜亞種（A. avenae subsp. citrulli）。

3 討論

本研究采集廣西區疑似甜瓜細菌性果斑病樣品2份，對其進行分離純化，編號WM0922的樣品分離獲得5株菌株，編號XD0611的樣品分離獲得8株菌株。對分離獲得的菌株進行致病性測定，結果發現編號WM0922-2、WM0922-3和WM0922-4的菌株能夠侵染厚皮甜瓜子葉，表現相同癥狀；菌株編號XD0611-5、XD0611-6、XD0611-7和XD0611-8的菌株能夠侵染薄皮甜瓜果皮，表現相同癥狀；且能再次分離后得到培養性狀相同的病菌，說明菌株為引起該病害的病原菌。據相關文獻報道（趙廷昌等，2001），該病原菌可侵染多種葫蘆科作物，因此擇優選取具有代表性的菌株WM0922-3和XD0611-7對葫蘆苗進行致病性測定，結果發現，2株供試菌株均可引起葫蘆子葉相同的水浸狀病斑。

供試菌株WM0922-3、XD0611-7和陽性對照B+的生理生化測定結果相同，與國內外的研究結果基本一致，但個別特性仍有些許差異，其中明膠液化結果為陽性，與趙廷昌等（2001）、任小平等（2010）相同，但與金巖等（2004）、王曉東等（2010）不同；淀粉水解結果為陽性，與王曉東等（2010）相同，但與趙廷昌等（2001）、蔡學清等（2005）不同；V-P試驗結果為陰性，與王曉東等（2010）相同，但與張悅麗等（2014）不同；馬鈴薯軟化試驗結果與金巖等（2004）、吉訓聰等（2012）相同，均可引起馬鈴薯軟化腐爛，但與趙廷昌等（2001）、王曉東等（2010）不同。其原因可能是由于病害采集地理位置不同、氣候條件差異及菌株株系間存在遺傳分化，導致不同菌株特性間的細微區別。

對供試菌株WM0922-3和XD0611-7進行16S rDNA序列擴增及序列測定分析，結果發現，2株供試菌株與A.citrulli各菌株16S rDNA的相似性均在99%以上。從系統發育進化樹中發現，WM0922-3與鄭州地區和北京地區A. citrulli具有較近的親緣關系，XD0611-7與海南地區A.citrulli具有較近的親緣關系。因甜瓜細菌性果斑病是典型的種傳病害，帶菌種子的調運是主要傳播途徑之一，故推測供試菌株與其他地區具有較近親緣關系的原因可能與甜瓜生產中帶菌種子的調運有關。

綜合以上結果，確定了廣西區內厚皮甜瓜和薄皮甜瓜上分離得到的病原菌均為燕麥嗜酸菌西瓜亞種（A. avenae subsp. citrulli）。此病原菌可引起甜瓜細菌性果斑病，且具有危害重、傳播迅速、防治困難等特點，今后應加強引種的檢疫，封鎖發病區，徹底銷毀病株、消毒病土，以控制該病害的蔓延，避免造成經濟損失。本研究明確了廣西甜瓜細菌性果斑病的病原及其生理特性，對該病害的檢驗檢疫、抗病育種和綜合防控具有重要意義。但對于該病原菌的致病類型、寄主范圍和藥劑防治，還有待進一步研究。

4 結論

本研究采用傳統細菌鑒定方法和現代分子生物學技術對廣西厚皮甜瓜和薄皮甜瓜上疑似細菌性果斑病的病原進行分離和鑒定，明確該病原菌為燕麥嗜酸菌西瓜亞種（A. avenae subsp. citrulli）。

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（責任編輯 麻小燕）