HPLC法測定磺胺對甲氧嘧啶片中磺胺對甲氧嘧啶的含量

章厲劼 王慶紅 金曉峰

摘 要：建立了獸藥磺胺對甲氧嘧啶片中磺胺對甲氧嘧啶含量的高效液相色譜測定法。以十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑，0.1%磷酸溶液-乙腈（80：20）為流動相，檢測波長為270nm，流速為1.0mL/min，柱溫40℃，采用外標法進行定量。磺胺對甲氧嘧啶的線性范圍0.005～0.10mg/mL，回歸方程為Area=71641.62×Amt+3.01（n=5），相關系數大于0.99999。磺胺對甲氧嘧啶片中磺胺對甲氧嘧啶三個添加濃度的添加回收率均均在98.2%～103.0%之間，RSD分別為0.51%、1.1%、0.87%。該方法簡單，準確，穩定性，精密度好，回收率高，可以用于測量磺胺對甲氧嘧啶片中磺胺對甲氧嘧啶的含量。

關鍵詞：磺胺對甲氧嘧啶片；磺胺對甲氧嘧啶；高效液相色譜

Abstract：An HPLC method has been devloped to determine the content of sulfamethoxydiazine in sulfamethoxydiazine Tablets. With eighteen alkyl silane bonded silica as filler， 0.1% phosphoric acid solution - acetonitrile （80：20） as mobile phase. The detection wavelength is 270nm， the flow rate is 1.0mL/min， the column temperature is 40 degrees Celsius， Quantitatively by external standard method. Sulfamethoxydiazine in the linear range of 0.005～0.10 mg/mL， the regression equation is Area=71641.62×Amt+3.01（n=5）， The correlation coefficient is greater than 0.99999. Sulfamethoxydiazine tablets sulfamethoxydiazine add three concentrations were between recoveries were 98.2%～103.0%， and RSD were 0.51%， 1.1%， 0.87%. The method is simple， accurate， stability， precision， high recovery rate， can be used to measure sulfamethoxydiazine Tablets methoxy pyrimidine sulfonamides content.

Key words：sulfamethoxydiazine tablets；sulfamethoxydiazine；HPLC

磺胺對甲氧嘧啶（C11H12N4O3，簡稱SMD）作為一種磺胺類藥，屬于長效磺胺。磺胺對甲氧嘧啶用于控制畜禽細菌性疾病和雞球蟲病[ 9 ]，對革蘭氏陰性菌有效，對化膿性鏈球菌、肺炎球菌、傷寒桿菌、沙門氏菌、鼠疫桿菌、和肺炎桿菌均有良好的抗菌作用，常用作飼料添加劑及畜禽疾病的治療和預防[ 7 ]。

其具有乙酰化率低，毒性和副作用小，主要經腎臟排泄等優點[ 8 ]。《中華人民共和國獸藥典》中磺胺對甲氧嘧啶片[ 1 ]中磺胺對甲氧嘧啶的含量測定采用的是永停滴定法，但在實際檢測中，發現該方法穩定性差，懷疑可能是制劑中的輔料干擾了電極的感應，有些廠家生產的磺胺對甲氧嘧啶片用永停滴定法根本無法準確的檢測磺胺對甲氧嘧啶的含量，不能有效進行質量控制。

本研究建立了磺胺對甲氧嘧啶片中磺胺對甲氧嘧啶含量的高效液相色譜測定法，并根據《中華人民共和國獸藥典》中“獸藥中藥質量標準分析方法驗證指導原則”[ 1 ]對新建方法的準確度、精密度、專屬性、耐用性、穩定性及線性等進行了研究。

1 材料

1.1 儀器和試藥

Agilent 1260 Infiinity高效液相色譜儀（配紫外檢測器）；

ZYT-1全自動永停滴定儀（無錫科達）；

超聲波清洗器（KQ-300DE，昆明市超聲儀器廠）；

BP211D型電子分析天平（德國賽多利斯公司）；

磺胺對甲氧嘧啶鈉對照品（Dr.Ehernstorfer GmbH公司，批號：10228，含量：99.0%）；

磺胺對甲氧嘧啶原料（湖北欣達利生化有限公司，批號為：20121001）試驗樣品由成都乾坤動物藥業有限公司生產提供（批號：20130101、20130102、20130103，規格：0.5g）；

乙腈（色譜純）；

水為超純水；其他試劑為分析純。

2 方法

2.1 藥典方法

《中華人民共和國獸藥典》2010年版一部中“磺胺對甲氧嘧啶片”含量測定項下方法[ 1 ] 。

2.2 色譜方法

2.2.1 色譜條件

色譜柱：Luna 5μ C18（2） 5μm 4.6×250mm；柱溫：40℃；0.1%磷酸溶液-乙腈（80：20）為流動相；流速：1.0mL/min；檢測波長為270nm[ 3 ]；進樣體積為20μL。

2.2.2 對照品溶液的制備

取磺胺對甲氧嘧啶鈉對照品約54mg（相當于含磺胺對甲氧嘧啶50mg），精密稱定，置50ml量瓶中，加鹽酸10mL，超聲處理（功率250W，頻率20kHz）5分鐘，取出，加水稀釋至刻度。即得濃度為1.0mg /mL的磺胺對甲氧嘧啶對照品儲備溶液。精密量取5mL濾液置于100mL容量瓶中，加流動相稀釋至刻度，即得50μg/mL的磺胺對甲氧嘧啶對照溶液。

2.2.3 供試樣品處理

取本品10片，精密稱定，研細，精密稱取適量（約相當于磺胺對甲氧嘧啶0.2g）置200ml量瓶中，加鹽酸10mL，超聲處理（功率250W，頻率20kHz）5分鐘，取出，加水稀釋至刻度。精密量取5mL濾液置于100mL容量瓶中，加流動相稀釋至刻度，搖勻，濾過，取續濾液，即得供試品溶液。

3 結果

3.1 藥典方法

取成都乾坤動物藥業有限公司提供的批號為20130101、20130102、20130103的磺胺對甲氧嘧啶片及湖北欣達利生化有限公司生產的批號為20121001的磺胺對甲氧嘧啶原料藥物按2.1項進行處理測定。以測定結果的相對偏差RSD表示試驗的精密度，RSD分別為8.30%、4.86%、13.96%、0.18%。

可見成都乾坤動物藥業有限公司提供的磺胺對甲氧嘧啶片檢測結果穩定性差，偏差較大，而磺胺對甲氧嘧啶原料藥物的檢測結果穩定性較好。

原因可能是成藥制劑中某種輔料對電極的電流造成干擾，使全自動永停滴定儀無法準確判斷終點，而原料藥物中沒有這種輔料，所有電極不受干擾，檢測結果穩定、偏差小。結果見表1。

3.2 色譜方法

3.2.1線性范圍

精密量取1.0mg /mL磺胺對甲氧嘧啶對照品儲備溶液0.5、1.0、2.5、5.0、10.0mL，分別置于100mL容量瓶中，加流動相稀釋至刻度，得含甘草酸濃度分別為0.005、0.01、0.025、0.050、0.10mg/mLmg/mL的對照溶液系列。注入高效液相色譜儀。

磺胺對甲氧嘧啶濃度在0.005～0.10mg/mL范圍內，有良好的線性關系，回歸方程為Area=71641.62×Amt+3.01（n=5），相關系數大于0.99999，對照品溶液色譜圖及標準曲線見圖1。

3.2.2精密度

取成都乾坤動物藥業有限公司提供的批號為20130101、20130102、20130103的磺胺對甲氧嘧啶片各10片，精密稱定，研細。批號為20130101稱取6份，批號為20130102、20130103各取2份，按2.2.3項進行處理，每個樣品進樣2針，進行含量測定，以Luna 5μ C18（2） 5μm 4.6×250mm為色譜柱，采用50μg/mL的磺胺對甲氧嘧啶對照溶液進行單點定量（除非特別說明，均以Luna 5μ C18（2） 5μm 4.6×250mm為色譜柱，用50μg/mL的磺胺對甲氧嘧啶對照溶液進行單點定量計算，下同）。供試品溶液色譜圖見圖2。RSD分別為0.27%、0.41%、0.16%，表明方法的精密度良好。結果見表2。

3.2.3準確性

稱取湖北欣達利生化有限公司生產的批號為20121001的磺胺對甲氧嘧啶原料藥物3份，按2.2.3項進行處理，每個樣品進樣2針，進行含量測定。結果見表3。

稱取2.2中研細的批號為20130101的磺胺對甲氧嘧啶片9份，按高（H）、中（M）、低（L）三個濃度水平分加添加磺胺對甲氧嘧啶原料藥物，每個濃度添加3份，按2.2.3項進行處理，每個樣品進樣2針，進行含量測定。結果見表3。

結果表明，三個添加水平的磺胺對甲氧嘧啶的回收率均在98.2%～103.0%之間，RSD分別為0.51%、1.1%、0.87%，方法具有良好的準確性。

3.2.4耐用性

取2.2項下處理的樣品，保持流動相比例不變，使用Luna 5μ C18（2） 5μm 4.6×250mm色譜柱，柱溫：30℃，流速：0.9mL/min下進行測試，磺胺對甲氧嘧啶片含量分別為98.2%、96.0%、97.8%；使用安捷倫 ZORBAX SB-C18 5μm 4.6×250mm，柱溫：40℃，流速：1.0mL/min下進行測試，磺胺對甲氧嘧啶片含量分別為97.2%、95.8%、97.3%。三種色譜條件下測定結果無明顯差異，說明耐用性良好。

3.2.5專屬性

在樣品測試色譜圖中，標準出峰時間附件未發現明顯的干擾峰。取不含磺胺對甲氧嘧啶的溶液測定，在磺胺對甲氧嘧啶的保留時間，也沒有對應峰。可見方法的專屬性良好。

3.2.6穩定性

取3.2.2的供試品溶液，放置5天后，再次測定，磺胺對甲氧嘧啶含量分別為97.4%、96.8 %、97.9%，與3.2.2的測定結果無顯著差異，說明穩定性好。

4 討論與結論

4.1 色譜條件的優化

參考其他磺胺類藥物的含量測定、磺胺類藥物殘留檢測方法及相關文獻雜志，高效液相色譜法測定磺胺對甲氧嘧啶片中磺胺對甲氧嘧啶所使用的流動相系統有磷酸鹽溶液-甲醇（65+35）[ 3 ]、磷酸二氫鉀（0.5mol/L）-磷酸氫二鈉（0.5mol/L）-甲醇（40：40：20）[ 4 ]、0.017 mol/L磷酸-乙腈（80+20）[ 5 ]、0.1%磷酸溶液-乙腈（90∶18） [ 6 ]等。采用流動相為0.1%磷酸溶液-乙腈（80：20）時，配置簡單，對色譜柱的柱效損傷小。

磺胺對甲氧嘧啶的出峰時間適當，峰形良好，理論塔板數均也能達到《中華人民共和國獸藥典》[ 1 ]規定要求。

4.2 樣品處理的優化

在進行樣品處理的過程中，分別采用10mL鹽酸、20mL鹽酸、10mL稀鹽酸、10mL 0.4%的NaOH[ 2 ]溶液溶解后，超聲處理5～10min，然后再加水定容。發現采用10mL鹽酸溶解，可以降低成分制劑中輔料對磺胺對甲氧嘧啶的吸附，增強磺胺對甲氧嘧啶的溶解，從而提高磺胺對甲氧嘧啶的回收率。且供試品溶液不會因酸度太高而影響到C18柱的柱效與壽命。

4.3 色譜條件的改變

保持流動相比例和流速不變，分別在島津LC2010及Agilent 1260 infinity 色譜儀上分別使用菲羅門Luna 5μ C18（2） 5μm 4.6×250mm色譜柱和ZORBAX SB-C18 5μm 4.6×250mm色譜柱于30℃及40℃條件下對樣品進行測試，磺胺對甲氧嘧啶的保留時間有變化，但檢測結果無影響。可見方法適用于不同設備、不同色譜條件下。

4.4 對比

3.1和3.2.3分別用永停滴定法及高效液相色譜法對湖北欣達利生化有限公司生產的批號為20121001的磺胺對甲氧嘧啶原料藥物進行了含量測定，含量分別為90.7%和91.3%，兩種方法的結果偏差為0.33%。可見兩種方法的檢測結果基本一致，也證明了高效液相檢測方法的準確性與可行性。

4.5 建立磺胺對甲氧嘧啶片中磺胺對甲氧嘧啶含量的高效液相色譜法測定是可行的

各方法學指標均比較理想，可以作為磺胺對甲氧嘧啶片中磺胺對甲氧嘧啶含量檢測標準。現有方法采用永停滴定法測量磺胺對甲氧嘧啶含量，最少操作容易，設備要求簡單，運行成本低，但測定時無法與磺胺間甲氧嘧啶區分，還需要作硫酸銅沉淀的鑒別反應來鑒其真偽，且遇到輔料對電極會造成干擾的情況時，是無法對磺胺對甲氧嘧啶的含量進行準確測量的。

在科學日益進步，實驗室檢測條件及檢測能力不斷提升的時代，高效液相色譜法更適合于永停滴定法檢測磺胺對甲氧嘧啶片中磺胺對甲氧嘧啶的含量。

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