漆酶的研究進展及其應用

劉巖 劉銳 蘇新國 趙冠里 楊昭

摘 要：漆酶是一種多酚氧化酶，由于其在自然界分布廣泛，并且在環保、紡織、印染、食品、化學合成等方面都具有廣泛的應用前景，近年來得到了廣泛的關注和研究。該文主要綜述了國內外漆酶的研究進展及其應用，為細菌漆酶提供新的應用前景和方向。

關鍵詞：漆酶；研究進展；應用

中圖分類號 Q814 文獻標識碼 A 文章編號 1007-7731（2016）13-0025-04

1 引言

漆酶（EC 1.10.3.2）又名藍色多銅氧化酶，可以氧化包括酚類物質、多酚類物質、苯胺、木質素、多環芳香烴甚至無機物等一系列物質，以分子氧氣為電子受體，生成反應過程中唯一的副產物水。因此，其在有毒廢水處理、染料脫色、紡織、造紙、酒及飲料、生物傳感器、抗癌藥物及化妝品合成等方面都具有廣泛的應用前景，從而受到了科學界的重視。當前應用最多的是真菌漆酶，但由于真菌漆酶不耐高溫，在堿性條件下迅速失活，存在多種抑制劑，嚴重限制了其工業化應用。真菌漆酶一般為含有糖基的糖蛋白，形成了基因工程改造及異源表達上的障礙。細菌漆酶一般為單體蛋白，且具有耐高溫，在堿性條件下穩定，抑制劑少等優點，可以克服真菌漆酶應用的缺點，具有巨大的應用潛力。

2 國內外研究現狀及進展

漆酶為藍色多銅氧化酶中最大的一類，具有通過銅粒子將多酚物質氧化，同時將氧氣還原成水的催化特性[1]。早在1883年，Yoshida第一次在日本漆樹中發現了漆酶，成為世界上最早的被發現的酶類之一[2]。植物漆酶由于缺少工業應用價值，而長期被忽視。在現代工業廢水中去除多酚類有毒物質，在紡織印染中去除木質素、色素等生物技術的不斷研發中，由于漆酶具有利用氧氣作為電子受體，能夠氧化多酚類、木質素等多種化學物質，同時生成唯一的副產物水，這些自身具備的優質條件使得漆酶的催化性質在環保、紡織、印染、食品、化學合成方面具有廣泛的應用前景，成為最近10年科學界最關注的焦點之一[3]。新型漆酶的研發，漆酶空間結構及其催化機理，酶學性質與應用等成為科學研究的熱點。我國的研究人員也逐漸認識到漆酶在工業領域的應用優勢，近些年研究勢頭迅猛[4-10]。

2.1 漆酶在自然界的分布 漆酶在自然界中廣泛分布。第一種漆酶是由日本人Yoshida在1883年在植物漆樹（Rhus vernicifera）樹脂中發現的，隨后在多種植物如楊樹[11]、煙草[12]等中均有發現。在多種真菌中均檢測到真菌漆酶的活性，到2008年經學者統計已經超過百種真菌漆酶被分離提純[13]，而這個數字還在快速的增加[14-16]。長期以來，人們一直以為漆酶僅僅存在于真核生物，直到1993年Givaudan首先在水稻根圍土壤中分離得到一株產漆酶的脂固氮螺菌[17]，這是第一次在原核生物中發現了產漆酶菌株。2000年Alexandre通過生物信息學技術，證實漆酶也普遍存在于原核生物中[18]。迄今為止，已經分離提純的細菌漆酶有海洋微生物Marinomonas mediterranea產生的多酚氧化酶PPQ[19]，假單胞菌屬的CopA蛋白[20]，鏈霉菌屬的類漆酶EpoA[21]，枯草芽孢桿菌中芽孢外被上面含有CotA蛋白[22]等。而產漆酶細菌也在不斷的被發現，如2009年Telke在印度染織廠廢水流經的土壤中篩選出產漆酶的假單胞菌LBC1[23]，2009年在突尼斯城市土壤中篩選得到產漆酶嗜麥芽寡養單胞菌AAP56[24]，2010年Wang等在黑龍江森立的土壤中分離得到產漆酶的枯草芽孢桿菌WD23菌株[25]。但是相對真菌漆酶，關于細菌漆酶的研究還是非常少的。

2.2 漆酶的性質 通過對真菌漆酶X晶體衍射，分析其空間結構與催化機理，可知漆酶每個催化單位結合有四個銅粒子，根據其電子順磁共振光譜，將四個銅粒子分成三種類型，第一種類型（T1）銅粒子賦予蛋白藍色，并在610nm處具有吸收峰，第二類型（T2）銅粒子與一對第三類型的（T3）銅粒子形成一個三角環區（trinuclear cluster TNC）[26]。在催化反應過程中，T1銅粒子在反應底物中依次接受四個電子，通過His–Cys–His三肽將電子傳遞給TNC，氧氣在TNC處被還原成水。其中T1銅粒子的氧化還原電位決定了漆酶的催化效率[27]。漆酶利用氧氣作為電子受體，將酚式羥基轉化成為自由基引發一些反應，進而導致烷基鏈上C-C和C-O鍵和芳香環鍵的斷裂[28]。漆酶的氧化還原電位一般≤0.8V，而非酚化合物的氧化還原電勢大約在1.3V左右，所以此類物質不能被漆酶直接氧化[29]。對于這類氧化還原電勢高于漆酶的化合物，或者由于分子空間結構較大不能直接接觸漆酶活性中心的大分子物質，可以通過添加化學介導物質作為電子穿梭機（electron shuttles）進而協助漆酶完成催化反應。真菌漆酶獨自或者在添加化學介導物的條件可以利用氧氣為電子受體，氧化酚類、多酚類、苯胺、木質素、多環芳香烴甚至無機物等一系列物質，同時將氧氣轉變成為水。酶促反應需要空氣中的氧氣，而唯一的副產物為水。與需要添加Mn+2木質素過氧化物酶（lignin peroxidase，LiP）和添加藜蘆基醇錳過氧化物酶（manganese peroxidase，MnP）相比，具有巨大優勢。

2.3 漆酶-介導反應體系（LMS）和化學介導物質 1990年，Bourbonnais首先報道了在添加2，2'-連氮基-雙-（3-乙基苯并二氫噻唑啉-6-磺酸）二銨鹽（ABTS）的情況下，可以利用漆酶氧化非酚木質素模型分子[30]，這一發現導致LMS體系的建立。LMS體系極大地擴大了漆酶的作用范圍，從此以后，科學界在研究LMS體系反應機理，尋找化學介導物質作了大量的研究工作。化學介導物質可以分為合成物質和天然物質兩種，常用的合成化學介導物質有ABTS、1-羥基苯并三唑（HBT）、N-羥基鄰苯二甲酰亞胺（HPI）等[29]。為了克服合成的化學介導物質價格昂貴、具有毒性等缺點，學者同時致力開發天然的化學介導物質。朱紅密孔菌（Pycnoporus cinnabarinus）的一種次級代謝產物3-Hydroxyanthranilic acid是報道的第一種天然介導物質[31]。2005年Camarero創建了活性黑5為漆酶作用底物，檢測吸光度變化篩選天然化學介導物質的篩選方法，并得了到10種天然酚類介導物質[32]。到2008年，已有將近100多中化學介導物質[12]。但是上述LMS體系建立往往都是針對真菌漆酶，關于細菌漆酶的LMS體系的研究還鮮有報道。

2.4 漆酶的應用

2.4.1 在處理頑固污染方面的應用 石油精煉、造紙廠、化工廠、農藥廠、鑄造廠和印染廠中產生的廢水經常含有大量的酚類、多環芳香等有毒有色難降解物質，去除這些難降解有毒大分子物質一直是污水處理工程中的一個難題。漆酶單獨或者建立LMS體系，可以將此類生物難降解物質氧化，轉變成無色，無毒可生物降解物質。2002年，Tsioulpas利用多種可產漆酶菌株降解橄欖油廠中含有酚類化合物廢水，其中酚類物質可以去除69%～76%，同時廢水顏色有黑色轉變成透明的淺黃色。2005年，Ryan報道了利用白腐霉（CBS 696.94）去除廢水中酚類物質，可以達到每1d每1g生物量降解0.033g酚類物質。2010年Wang利用自己篩選的產細菌漆酶WD23將雷馬素艷藍R、茜素紅、干果紅、甲基橙、甲基紫等染料降解50%～90%。

2.4.2 在其它方面的應用 在造紙工業中，可采用漆酶LMS系統對紙漿進行漂白并去除木質素[33-34]，來取代傳統的對環境會造成重大污染的氯化物漂白工藝。在紡織工業中，除去利用漆酶降解其中含染料廢水外，還可以利用漆酶進行布料漂白[35]。1996年Novozyme公司開發了第一款在用于牛仔褲仿舊處理的漆酶產品DeniLit。2001年Zytex公司開發了降解靛藍的漆酶商品Zylite。在食品方面，漆酶可以通過選擇性去除食品多酚類物質，進而提高其產品風味口感，降低成本等[36]。漆酶在化學合成，木質素降解生產生物能源，生物傳感器等方面也具有廣泛的應用[37]。

3 前景與展望

利用微生物酶大規模工業化生產被稱之為生物技術或者綠色化學，是歐洲倡導的生物經濟的主要領域之一。而能在工業化生產中應用的酶類，必須具備一定的抗高溫，耐強堿，抵抗剪切力，在一定的儲存期間不會失活等優良性質[38]。真菌漆酶的使用范圍為pH4～6，溫度30～50℃[38]，且多種物質敏感，氯化物、疊氮化合物、氫氧化物等均可以抑制真菌漆酶的活性[39]。為了改善漆酶性質，降低生產成本，利用基因工程進行異源表達是行之有效的方法。但是由于真菌漆酶為糖蛋白，且其糖基對漆酶的特性及其活性具有重要影響，因此真菌漆酶在異源表達上困難重重[40]，直到現在還沒有真菌漆酶在大腸桿菌中表達成功的報道[39，40]。

細菌漆酶能彌補真菌漆酶所具有的缺點，其一般不具有糖蛋白，易于進行異源表達，進行基因改造和大規模發酵生產。細菌漆酶一般最適作用pH為堿性環境，耐高溫，對抑制劑不敏感。如Wang報道的枯草芽孢桿菌WD23產生的漆酶在80℃下半衰期為2.5h，pH為9的條件下半衰期為15d[25]。芽孢桿菌C-125得到一種漆酶，其最適作用pH為7.5～8，氯化物對其不但沒有抑制作用反而可以刺激提高酶活[41]。細菌漆酶展現出了巨大的應用潛力。但是現在關于細菌漆酶的研究太少，嚴重阻礙了細菌漆酶的應用[26，38，40]。因此，開展對細菌漆酶的廣泛研究具有重要的意義。

參考文獻

[1]SOLOMON E I，SUNDARAM U M，MACHONKIN T E.Multicopper Oxidases and Oxygenases[J].Chemical Reviews，1996，96（7）：2563-2606.

[2]MAYER A M，STAPLES R C.Laccase：new functions for an old enzyme[J].Phytochemistry，2002，60（6）：551-565.

[3]RIVA S.Laccases：blue enzymes forgreen chemistry[J].Trends Biotechnol，2006，24（5）：219-226.

[4]潘志恒，岳鵾，孫勇民，等.漆酶在食品工業中的應用與研究進展[J].農產品加工，2016，4：49-51，54.

[5]劉輝，韓振亞，蘇煥斌，等.漆酶及其產生菌應用研究進展[J].廣東化工，2016，43（7）：100-101.

[6]羅爽，謝天，劉忠川，等.漆酶/介體系統研究進展[J].應用與環境生物學報，2015，21（6）：987-995.

[7]崔靜，張平，王清清，等.固定漆酶對對苯二酚的降解研究[J].化工新型材料，2015，43（12）：181-183.

[8]張瑞景，李慧星，張建華，等.漆酶_HOBT體系對苯胺藍的脫色條件及機理研究[J].安全與環境學報，2015，15（6）：233-238.

[9]宋亮輝.漆酶降解羥基多溴聯苯醚反應動力學及產物[J].輕工科技，2016，5：29-32.

[10]張磊，鄭潔.固定化漆酶對染料脫色的研究[J].河南科技，2016，01：128-129.

[11]RANOCHA P，MCDOUGALLg，HAWKINS S，et al.Biochemical characterization，molecular cloning and expression of laccases–a divergentgene family–in poplar[J].European Journal of Biochemistry，1999，259（1-2）：485-495.

[12]DE MARCO A，ROUBELAKIS-ANGELAKIS K A.Laccase activity could contribute to cell-wall reconstitution in regenerating protoplasts[J].Phytochemistry，1997，46（3）：421-425.

[13]KUNAMNENI A，PLOU F J，BALLESTEROS A，et al.Laccases and their applications：a patent review[J].Recent Pat Biotechnol，2008，2（1）：10-24.

[14]ZHANGg-Q，WANG Y-F，ZHANG X-Q，et al.Purification and characterization of a novel laccase from the edible mushroom Clitocybe maxima[J].Process Biochemistry，2010，45（5）：627-633.

[15]WU Y-R，LUO Z-H，KWOK-KEI CHOW R，et al.Purification and characterization of an extracellular laccase from the anthracene-degrading fungus Fusarium solani MAS2[J].Bioresource Technology，2010，101（24）：9772-9777.

[16]LAKHTAR H，ISMAILI-ALAOUI M，PHILIPPOUSSIS A，et al.Screening of strains of Lentinula edodesgrown on model olive mill wastewater in solid and liquid state culture for polyphenol biodegradation[J].International Biodeterioration & Biodegradation，2010，64（3）：167-172.

[17]gIVAUDAN A，EFFOSSE A，FAURE D，et al.Polyphenol oxidase in Azospirillum lipoferum isolated from rice rhizosphere：Evidence for laccase activity in non-motile strains of Azospirillum lipoferum[J].FEMS Microbiology Letters，1993，108（2）：205-210.

[18]ALEXANDREg，ZHULIN I B.Laccases are widespread in bacteria[J].Trends in Biotechnology，2000，18（2）：41-42.

[19]SOLANO F，GARCIA E，PEREZ DE EGEA E，et al.Isolation and Characterization of Strain MMB-1 （CECT 4803），a Novel Melanogenic Marine Bacterium[J].Appl Environ Microbiol，1997，63（9）：3499-3506.

[20]MELLANO M A，COOKSEY D A.Nucleotide sequence and organization of copper resistancegenes from Pseudomonas syringae pv.tomato[J].J Bacteriol，1988，170（6）：2879-2883.

[21]ENDO K，HAYASHI Y，HIBI T，et al.Enzymological Characterization of EpoA，a Laccase-Like Phenol Oxidase Produced by Streptomycesgriseus[J].Journal of Biochemistry，2003，133（5）：671-677.

[22]DRIKS A.Bacillus subtilis Spore Coat[J].Microbiol Mol Biol Rev，1999，63（1）：1-20.

[23]TELKE A A，KALYANI D C，JADHAV U U，et al.Purification and characterization of an extracellular laccase from a Pseudomonas sp.LBC1 and its application for the removal of bisphenol A[J].Journal of Molecular Catalysis B：Enzymatic，2009，61（3-4）：252-260.

[24]gALAI S，LIMAM F，MARZOUKI M.A New Stenotrophomonas maltophilia Strain Producing Laccase.Use in Decolorization of Synthetics Dyes[J].Applied Biochemistry and Biotechnology，2009，158（2）：416-431.

[25]WANG C L，ZHAO M，LI D B，et al.Isolation and characterization of a novel Bacillus subtilis WD23 exhibiting laccase activity from forest soil[J].Advanced Materials Research，2010，113（725-729.

[26]SHARMA P，GOEL R，CAPALASH N.Bacterial laccases[J].World Journal of Microbiology and Biotechnology，2007，23（6）：823-832.

[27]BALDRIAN P.Fungal laccases - occurrence and properties[J].FEMS Microbiol Rev，2006，30（2）：215-242.

[28]gIARDINA P，FARACO V，PEZZELLA C，et al.Laccases：a never-ending story[J].Cellular and Molecular Life Sciences，2010，67（3）：369-385.

[29]CANAS A I，CAMARERO S.Laccases and their natural mediators：biotechnological tools for sustainable eco-friendly processes[J].Biotechnol Adv，2010，28（6）：694-705.

[30]BOURBONNAIS R，PAICE Mg.Oxidation of non-phenolic substrates：An expanded role for laccase in lignin biodegradation[J].FEBS Letters，1990，267（1）：99-102.

[31]EGGERT C，TEMP U，DEAN J F D，et al.A fungal metabolite mediates degradation of non-phenolic lignin structures and synthetic lignin by laccase[J].FEBS Letters，1996，391（1-2）：144-148.

[32]CAMARERO S，IBARRA D，MARTINEZ M J，et al.Lignin-Derived Compounds as Efficient Laccase Mediators for Decolorization of Different Types of Recalcitrant Dyes[J].Appl Environ Microbiol，2005，71（4）：1775-1784.

[33]BOURBONNAIS R，PAICE M，FREIERMUTH B，et al.Reactivities of Various Mediators and Laccases with Kraft Pulp and Lignin Model Compounds[J].Appl Environ Microbiol，1997，63（12）：4627-4632.

[34]CAMARERO S，IBARRA D，MART NEZ ? T，et al.Paper pulp delignification using laccase and natural mediators[J].Enzyme and Microbial Technology，2007，40（5）：1264-1271.

[35]PAZARLIOG，LU N K，SARIISIK M，et al.Laccase：production by Trametes versicolor and application to denim washing[J].Process Biochemistry，2005，40（5）：1673-1678.

[36]MINUSSI R C，PASTOREg M，DUR N N.Potential applications of laccase in the food industry[J].Trends in Food Science & Technology，13（6-7）：205-216.

[37]RODRIGUEZ COUTO S，TOCA HERRERA J L.Industrial and biotechnological applications of laccases：a review[J].Biotechnol Adv，2006，24（5）：500-513.

[38]HILDEN K，HAKALA T K，LUNDELL T.Thermotolerant and thermostable laccases[J].Biotechnol Lett，2009，31（8）：1117-1128.

[39]MAJEAU J-A，BRAR S K，TYAGI R D.Laccases for removal of recalcitrant and emerging pollutants[J].Bioresource Technology，2010，101（7）：2331-2350.

[40]RODGERS C J，BLANFORD C F，GIDDENS S R，et al.Designer laccases：a vogue for high-potential fungal enzymes？[J].Trends in Biotechnology，2010，28（2）：63-72.

[41]RUIJSSENAARS H J，HARTMANS S.A cloned <；i>；Bacillus halodurans<；/i>； multicopper oxidase exhibiting alkaline laccase activity[J].Applied Microbiology and Biotechnology，2004，65（2）：177-182.