一株蠟樣芽胞桿菌B—21的發酵優化

閆洪雪 李麗 劉露 梁文輝 張鵬鵬 趙宏濤

摘要：對蠟樣芽胞桿菌B-21的生長情況進行培養觀測，通過最適溫度及最適初始pH值的選擇、碳氮源的單因素試驗確定最適培養條件及最適碳氮源。采用正交試驗的方法進一步確定各培養組分的最適配比，最終確定該菌培養基的有機組分最適用量為葡萄糖7g/L、玉米淀粉8g/L、豆餅粉6g/L，發酵菌數最高可達到120×10⁸cfu/mL。

關鍵詞：蠟樣芽胞桿菌；培養優化；單因素試驗；正交試驗

中圖分類號：S182 文獻標識號：A 文章編號：1001—4942（2016）03—0062—04

蠟樣芽胞桿菌（Bacillus cereus）是一種革蘭氏陽性菌，能夠形成芽胞，且芽胞有較強的抵御不良條件的抗性，能夠適應各種不同的環境生長。大多數蠟樣芽胞桿菌菌種與動植物有密切共生關系，且能夠產生多種生物活性物質，如各種蛋白酶、淀粉酶、抗菌素、纖維素酶，因此被廣泛應用于農業、飼料、食品、保健品等領域。近年研究發現，蠟樣芽胞桿菌作為植物根際促生菌（PGPR）具有較強的生態適應能力，是土壤中的優勢菌，它能夠促進植物生長，且對多種植物病害有明顯的抑制作用。

本試驗中所提及的蠟樣芽胞桿菌是從蘋果根系土壤中篩選獲得，經鑒定為益生菌，具有抑菌作用。通過對該菌株的發酵條件優化，提高其發酵活菌數，可進一步應用于工業生產，與本公司海藻肥料相結合，開發出抑菌促生的新型蘋果肥料，進一步提高蘋果的產量與質量。

1材料與方法

1.1菌種

本試驗所用蠟樣芽胞桿菌是從蘋果根系土壤中篩選所得，為本實驗室保存。

1.2儀器與試劑

超凈工作臺SW-CJ-2F（蘇凈集團蘇州安泰空氣技術有限公司）、旋轉式恒溫搖床THZ-D（江蘇太倉市實驗設備廠）、渦旋振蕩器（澳門市其林貝爾儀器制造有限公司）、恒溫培養箱LRH-150B（韶關市泰宏醫療器械有限公司）、紫外可見分光光度計UV-5100-5800（上海精密儀器廠）。

所用試劑為蛋白胨、玉米粉、酵母粉、豆餅粉、葡萄糖、麥芽糊精、玉米淀粉、脫脂豆粉、蔗糖、牛肉粉、NaCl、KH₂PO₄、（NH₄）₂SO₄、CaCO₃、NaOH、HCl、pH試紙。

1.3生長曲線的測定

斜面活化的B-21菌株用LB液體培養基培養。B-21菌懸液的OD值反映其隨著培養時間的菌數變化。在培養不同時間取樣，檢測菌懸液在波長為600 nm時的吸光度，繪制B-21菌株的生長曲線。

1.4培養條件優化

1.4.1培養溫度的選擇取1 mL對數期種子培養液接人50 mL滅菌前pH為7.0的LB液體培養基中，設置溫度梯度為26、28、30、32、34、36℃，搖床振蕩培養，轉速180 r/min，培養至芽胞轉化率95%以上停止培養，稀釋涂布法測菌數。

1.4.2初始pH值的選擇取1 mL對數期種子培養液接入50 mL滅菌前pH值分別為6.0、6.5、7.0、7.5、8.0、8.5的液體LB培養基中，設置轉速180 r/min，32℃搖床培養，至芽胞轉化率95%以上，稀釋涂布法測菌數。

1.5單因素試驗

1.5.1最適碳源選擇 分別以玉米粉、玉米淀粉、蔗糖和麥芽糊精作為長效碳源，用量為7g/L，其余成分為葡萄糖7g/L，豆餅粉6g/L，硫酸銨1g/L，磷酸二氫鉀1g/L，碳酸鈣1g/L配培養基。調節滅菌前培養基的pH值為7.5。接種B-21菌株后，32℃、180 r/min搖床振蕩培養。鏡檢觀察待芽胞轉化率95%以上時，稀釋涂布法計菌數。

1.5.2最適氮源選擇 分別以豆餅粉、牛肉粉、脫脂豆粉和蛋白胨作為單因素改變氮源，用量為6g/L，其余成分為玉米淀粉7g/L，葡萄糖7g/L，硫酸銨1g/L，磷酸二氫鉀1g/L，碳酸鈣1g/L配培養基。調節滅菌前培養基的pH值為7.5。接種B-21菌株后，32℃、180 r/min搖床振蕩培養。鏡檢觀察，待芽胞轉化率為95%以上時，稀釋涂布法計菌數。

1.6最佳配比選擇及驗證

根據L₁₆（4⁵）正交表，以該表前三列為準，設計三因素四水平的正交試驗。試驗變量的三個因素分別為葡萄糖、玉米淀粉、豆餅粉，對應的四個水平分別是4、5、6、7g/L；5、6、7、8g/L；4、6、8、10g/L。其他成分為硫酸銨1g/L，磷酸二氫鉀1g/L，碳酸鈣1g/L。調節滅菌前培養基pH值為7.5。

將B-21蠟樣芽胞桿菌分別接種到16瓶培養基中，32℃、180 r/min搖床振蕩培養。鏡檢觀察，待芽胞轉化率95%以上時，稀釋涂布法計菌數。

對試驗結果進行分析，根據正交試驗分析得出最佳配比后，再根據該組合各成分的配比配制培養基，調節滅菌前培養基pH值為7.5，32℃、180 r/min搖床振蕩培養該菌株，待芽胞轉化率95%以上時，稀釋涂布法計菌數，以驗證最優組合的可靠性。

1.7數據分析

用Microsoft Excel 2003分別統計發酵培養后的活菌數，制作圖表，得到該菌株的生長曲線、最適培養條件及最適培養基成分及配比。

2結果與分析

2.1 B-21的生長曲線

在不同時間取樣后，測得600 nm波長下B-21菌液的吸光度值，結果表明，用LB培養，B-21在培養3～16 h處于對數生長期，16 h的OD值超過1.5，在20～24 h達到最高峰，之后處于緩慢下降趨勢（圖1）。

2.2最適培養溫度

用LB培養基培養B-21菌株，培養溫度分別為26、28、30、32、34、36℃，發酵結束后計數結果表明，該菌的最適培養溫度是32℃（圖2）。

2.3滅菌前最適pH值

32℃條件下，用LB培養基培養B-21菌株，在不同初始pH值培養基培養后的計數結果如圖3所示。結果顯示該菌培養的滅菌前最適pH值為7.5。

2.4最適碳源

通過用不同碳源的培養基培養，發酵后計數結果如圖4所示。從圖中可以看出，使用玉米淀粉做碳源的處理B-21菌數最多，數量達到78×10⁸cfu/mL以上，因此培養該菌的最適碳源為玉米淀粉。

2.5最適氮源

確定最適碳源后，單因素改變氮源，發酵結束后，統計的菌數結果（圖5）顯示，培養B-21的最佳氮源為豆餅粉。試驗過程中脫脂豆粉菌數也較高，但重復試驗不穩定，故選擇豆餅粉作為最佳氮源。

2.6正交試驗結果

在單因素試驗確定最適碳源、氮源后，為進一步優化培養基，采用正交試驗的方法對培養基的有機組分進行試驗，尋找最佳配比。統計的菌數結果如表1所示。

從表1中可看出，B-21的最佳培養基有機組分為葡萄糖7g/L，玉米淀粉8g/L，豆餅粉6g/L。極差分析可知，各因子對活菌數影響的大小為葡萄糖>玉米淀粉>豆餅粉。

進一步進行驗證試驗，以最佳處理組合的培養基發酵培養B-21菌株，菌量達120×10⁸cfu/mL，表明培養基有機組分為葡萄糖7g/L、玉米淀粉8g/L、豆餅粉6g/L即為本試驗的最佳處理組合。

3結論與討論

蠟樣芽胞桿菌近年來廣泛應用于動物飼料、食品與保健、植物肥料等的生產，具有促生與抑菌的作用。本研究通過觀察一株蠟樣芽胞桿菌B-21的生長情況，通過一系列試驗，確定了其最佳培養溫度為32℃，最適初始pH值為7.5，最佳碳源為玉米淀粉，最佳氮源為豆餅粉。并通過正交試驗的進一步優化培養，確定了高產的培養基成分及最佳碳氮源配比，可使發酵菌數最高達到120×10⁸cfu/mL，為之后用于工業發酵生產提供了良好依據，為與本公司海藻肥料相結合，開發新型肥料奠定了基礎。