矮牽牛‘漫波紅色’再生及遺傳轉化體系的初步建立

董亞茹 王照紅 杜建勛 陳傳杰 趙東曉

摘要：以矮牽牛‘漫波紅色無菌苗葉片為外植體，建立無菌再生體系，并在此基礎上建立其遺傳轉化體系。結果表明，誘導矮牽牛葉片分化的最佳培養基為Ms+2.0 mg/L 6-BA+0.1 mg/LNAA；最佳生根培養基為1/2MS+0.1 mg/L NAA；最適出芽和生根的卡那霉素篩選壓分別為100 mg/L和20 mg/L；最適頭孢霉素抑菌濃度為200 mg/L。

關鍵詞：矮牽牛；漫波紅色；再生體系；遺傳轉化

中圖分類號：S681.603.6 文獻標識號：A 文章編號：1001—4942（2016）03—0014—04

矮牽牛比較容易再生，組織與細胞操作技術簡單，生活周期短，遺傳背景清晰，又是一種重要的園林花卉，因而其基因工程育種開展的較早，成為常見的轉基因花卉。并在植物基因工程育種、體細胞育種及單倍體育種方面均取得一定進展，基因工程育種已創造出新的矮牽牛品種并加以應用。國內外對矮牽牛組織培養方面的研究已經相當深入，曾進行過葉、莖、節間、葉肉原生質體、花粉粒、根分生組織、莖分生組織、芽、花瓣等外植體類型的研究。常用作矮牽牛組織培養外植體的有種子、帶芽莖段、莖尖、葉片、花蕾、花瓣、花藥等。

利用生物技術手段改變觀賞植物的性狀，創造優良新品種，是目前園林植物研究的一個熱點。本試驗以矮牽牛‘漫波紅色為材料，建立其再生體系以及遺傳轉化體系，為下一步農桿菌介導的轉基因研究做好準備工作，也為其他觀賞植物的轉基因研究奠定基礎。

1材料與方法

1.1試驗材料

以矮牽牛‘漫波紅色無菌苗為材料，取生長一致的無菌苗葉片做為外植體，接種在添加不同激素的MS基本培養基（附加蔗糖30g/L、瓊脂7.8g/L，pH 5.8～6.0）中，培養溫度為（25±2）℃，光照強度2 000～3 000 lX，光照時間16 h/d。

農桿菌菌株：EHA105；質粒：pROKⅡ，該表達載體含有NptⅡ基因，遺傳轉化時可通過卡那霉素抗性篩選獲得轉基因植株。

1.2試驗方法

1.2.1愈傷組織的誘導及芽的分化將無菌苗葉片切成5 mm×5 mm的方塊接種于添加不同濃度6-BA和不同濃度NAA的MS培養基上，遠軸面朝下。6-BA的濃度設為0.5、1.0、1.5、2.0mg/L，NAA的濃度設為0.05、0.1、0.5 mg/L，做正交設計。每處理30個外植體，3次重復，10 d繼代一次，30 d后統計葉片分化率及生長情況，選擇最佳芽分化培養基。分化率（%）=分化外植體數/外植體總數×100。

1.2.2生根培養切取生長一致的無菌再生壯苗，將其接種在添加不同濃度NAA的1/2MS培養基上。NAA的濃度設為0、0.05、0.1、0.5、1.0mg/L，每處理30個外植體，重復3次，10 d繼代一次，30 d后統計生根率及再生不定根的生長情況，選擇最佳生根培養基。生根率（%）=生根外植體數/外植體總數×100。

1.2.3卡那霉素選擇壓的確定①卡那霉素對外植體分化的影響：取矮牽牛無菌苗葉片切成5mm×5 mm大小，分別接種于添加0、25、50、75、100、150 mg/L卡那霉素的MS+2.0 mg/L 6-BA+0.1 mg/L NAA培養基中分化培養，每處理30個外植體，重復3次，10 d繼代一次，20 d后統計分

2.2生根培養

切取1.5 cm左右高的無菌再生苗接到添加不同濃度NAA的1/2MS培養基中，10 d左右時，化率。②卡那霉素對生根的影響：切取生長一致的無菌再生壯苗，分別接種于添加0、5、10、15、20、30 mg/L卡那霉素的1/2MS+0.1 mg/L NAA培養基中，每處理30個外植體，3次重復，10 d繼代一次，20 d后統計生根情況。

1.2.4除菌劑頭孢霉素濃度的篩選 ①頭孢霉素對農桿菌的抑制情況：取適量農桿菌EHA105菌液加入到含有不同濃度除菌劑的LB液體培養基中，設置0、100、200、300、400、500 mg/L頭孢霉素濃度梯度，28℃、180 r/min搖床暗培養48 h，測定OD值。②頭孢霉素對外植體分化的影響：將矮牽牛無菌葉片切成5 mm×5 mm大小，接種在分別添加0、100、200、300、400、500 mg/L頭孢霉素的MS+2.0 mg/L 6-BA+0.1 mg/L NAA培養基上，每處理30個外植體，重復3次，10 d繼代一次，20 d后統計分化結果。

2結果與分析

2.1愈傷組織的誘導及芽的分化

葉片接種5 d后，整體膨大，增厚，并發生卷曲（圖1）。一周后在葉片切口邊緣開始出現淺綠色的愈傷組織，葉脈處最為明顯。兩周后愈傷組織體積稍有變大，顏色變綠，在MS+0.5 mg/L6-BA+0.05 mg/L NAA培養基上最先有綠色芽點出現，主要集中在葉脈處。三周后大多數葉片變成黃色，同時一些芽體發育成幼苗。在MS+2.0 mg/L 6-BA+0.1 mg/L NAA培養基上芽的分化率最高，達到86.7%，且芽簇生密集。在1/2MS+0.05 mg/L NAA和1/2MS+0.1 mg/LNAA培養基中最先有錐狀白色凸起。NAA在0～1.0 mg/L濃度范圍內均能誘導生根，在不添加NAA的培養基中，生出大量的根，但根細、呈黃綠色，NAA濃度越高，生出的根越粗壯，但數量越來越少，且生根率達到一定值后出現下降。在

2.3卡那霉素選擇壓的確定

2.3.1卡那霉素對外植體分化的影響 卡那霉素在0～75 mg/L濃度范圍內，外植體有愈傷組織產生，隨著濃度增加，葉盤的愈傷膨大率降低，分化出的芽數也逐漸減少，死亡率依次增加。當卡那霉素濃度為75 mg/L時，外植體分化率為6.7%，而死亡率已達到63.3%；當卡那霉素濃度為100～150 mg/L時，大部分葉片黃化死亡，分化率為零（圖3）。因此，將100 mg/L作為卡那霉素抑制假陽性的臨界濃度。

2.3.2卡那霉素對生根的影響 在不添加卡那霉素的培養基中，再生苗植株生長正常，生根率達100%；在5～15 mg/L范圍內，隨著卡那霉素濃度的增加，生根率依次降低，且根系數量較不添加卡那霉素少，植株長勢弱；當卡那霉素濃度達到20mg/L時，生根率幾乎為零（圖4）。因此，在生根篩選時宜選擇卡那霉素濃度20 mg/L作為選擇壓。

2.4頭孢霉素濃度的篩選1/2MS+0.1 mg/L NAA培養基中，生根率達100%，且根粗壯、數量多（圖2）。因此，1/2MS+0.1 mg/L NAA為矮牽牛生根的最適培養基。

2.4.1頭孢霉素對農桿菌的抑制情況將農桿菌菌液加入到含有不同濃度頭孢霉素的LB液體培養基中，28℃、180 r/min暗培養48 h，菌的生長受到不同程度的抑制（圖5）。當頭孢霉素濃度為100 mg/L時，農桿菌繁殖受到一定抑制；當頭孢霉素濃度為200～500 mg/L時，農桿菌的OD值均小于0.5，且抑菌效果基本一致。考慮到高濃度的頭孢霉素會對外植體生長造成一定影響，因此初步確定200 mg/L為最適的抑菌濃度。

2.4.2頭孢霉素對外植體分化的影響 在0～500 mg/L濃度范圍內，隨著頭孢霉素濃度的升高，誘導出的愈傷組織量減少，外植體的分化率也逐漸降低（圖6），且分化出的芽生長緩慢，葉片發黃。因此，在轉化過程中，在有效抑制農桿菌生長的前提下，頭孢霉素濃度應采用一個較低值，以保證矮牽牛葉片能正常誘導分化。由于在200mg/L時頭孢霉素就能有效抑制農桿菌生長，所以在共培養結束后，第一次篩選時選用500 mg/L頭孢霉素，一周后，在后期培養中選用200 mg/L進行抑菌篩選培養，既可抑制農桿菌生長也不會影響外植體分化。3結論與討論

本研究以‘漫波紅色無菌植株葉片為外植體，成功建立了其無菌再生及遺傳轉化體系。不同的矮牽牛品種其再生方式存在差異，馬方芳等的研究結果表明‘幻想矮牽牛在MS+2.0mg/L6-BA+2.0 mg/L NAA培養基中直接再生出芽率達94.7%，且無明顯愈傷。而本研究中‘漫波紅色在MS+2.0 mg/L 6-BA+0.1 mg/LNAA培養基中出芽率最高，且有大量愈傷產生，6-BA在0.5～2.0 mg/L范圍內，濃度越高分化率越高，NAA濃度高于或者低于0.1 mg/L都不利于再生芽的產生。組織培養一般選用1/2MS培養基作為生根基礎培養基，再添加不同濃度的IBA或者NAA。張樹軍等在1/2MS培養基中添加0.5 mg/L的NAA，幾乎都能誘導出根。馬瑛以0.1 mg/L的IBA作為生根激素，生根率也達到100%。本研究采用NAA作為生根激素，0.1 mg/L濃度下的生根率達100%，且植株生長健壯。

有關矮牽牛遺傳轉化的研究也已有很多報道，但由于再生和遺傳轉化效率的基因型依賴性強，故不同品種其研究結果也不同。卡那霉素為雙子葉植物遺傳轉化時常用的選擇標記用抗生素，對植株再生有很大影響。本研究中，卡那霉素濃度為100 mg/L時才能完全抑制‘漫波紅色矮牽牛再生芽的產生，這與馮慧等的試驗結果一致。劉南南等用潮霉素進行敏感性試驗發現，10 mg/L的潮霉素就能完全抑制‘夢幻系列矮牽牛葉片分化生長。武術杰等用15mg/L卡那霉素便完全抑制了矮牽牛‘Tidal Wave品種再生芽的發生。本研究中，低濃度（20mg/L）的卡那霉素則可以抑制不定根的產生。司愛君等在矮牽牛的遺傳轉化試驗中采用30mg/L的卡那霉素進行生根篩選，對照植株完全不能生根。頭孢霉素是植物遺傳轉化中常用的一種抑菌劑，其使用濃度以完全抑制農桿菌的生長而不影響外植體分化為宜。孫艷香等研究結果顯示，300 mg/L頭孢霉素為‘交響曲系列矮牽牛遺傳轉化適宜的抑菌劑。本試驗中，200 mg/L頭孢霉素就有很好的抑菌效果，在0～500 mg/L范圍內，頭孢霉素濃度對外植體出芽率的影響差異不大，因此選擇200 mg/L為適宜的抑菌濃度。