心安顆粒對急性心肌梗死大鼠心肌纖維化的干預研究

葉麗莎 張德綢 白雪

西南醫科大學附屬中醫醫院心腦病科，四川瀘州 646000

冠心病屬于對人們健康產生嚴重威脅的一項疾病，而急性心肌梗死屬于冠心病表現的一種急危重癥。其心肌纖維化成為心室重構產生的主要因素，更是預后效果差預測的一項關鍵指標。如何防治心肌纖維化則成為目前研究的熱點。本項目以結扎左冠狀動脈制備的大鼠（即急性心肌梗死后心室重構動物）模型，利用電鏡、免疫組化等方法檢測左心室肥厚指數、心肌膠原容積分數（CVF）、Ⅰ型膠原容積分數（ⅠCVF）、基質金屬蛋白酶1（MMP-1）/基質金屬蛋白酶抑制劑1（TIMP-1），探討心安顆粒對改善急性心肌梗死大鼠心肌梗死后心肌纖維化的可能作用機制［1-9］。

1 資料與方法

1.1 實驗動物 成年正常雄性SD 大鼠40 只，清潔級，體質量160～185 g。由西南醫科大學動物實驗中心提供。

1.2 藥物心安顆粒 由黃芪、苦參、生地、麥冬、板藍根等組成，每克相當于原生藥2.4 g（由西南醫科大學附屬中醫醫院提供）?？ㄍ衅绽◤V東彼迪藥業有限公司）。

1.3 主要試劑與儀器 天狼星紅染色液試劑盒（生產廠家：索萊寶公司）；Trizol核酸提取液（生產廠家：Ambion公司）；MMP-1 抗體、TIMP1 抗體、Ⅰ型膠原蛋白抗體均為RD System 公司產品；光學顯微鏡（型號BX53，Olympus公司）。

1.4 動物造模 采用左冠狀動脈結扎的方法，制備急性心肌梗死后心肌重塑模型。

1.5 分組及給藥 將大鼠隨機數字表法分為假手術組、模型組、卡托普利組［20 mg/（kg·d）］、心安顆粒組［心安顆粒9 g/（kg·d）］，每組10 只。按所需劑量灌胃給予，每日1次，直至實驗終點（術后8周）。

1.6 檢測指標及方法 ⑴給藥療程結束后，對大鼠腹腔麻醉后取得其心臟組織，迅速放入多聚甲醛中固定，常規脫水石蠟包埋，切片，取心肌梗死組織塊待檢。⑵CVF 采用天狼星紅染色法對標本進行操作。測算CVF 使用Image-Pro Plus Version 6.0 軟件進行檢測。⑶ⅠCVF、MMP-1、TIMP-1蛋白表達采用免疫組化法檢測。免疫組化法進行檢測時，其陽性表達的標準是：細胞漿顯示棕黃色染色顆粒。針對圖像分析的時候選擇Image-Pro Plus Version 6.0 這一款軟件。⑷左心室肥厚指數：在給大鼠稱重（BW）以后再處死大鼠，將心臟組織全部取出，依次測定心臟質量（HW）及左心室質量（LVM），還要計算出大鼠的左心室肥厚指數，即心臟質量指數（HMI）=HW/BW，左心室質量指數（LVMI）=LVM/BW。

1.7 數據處理與統計分析方法 實驗結果除形態學照片外，實驗數據錄入SPSS 19.0，符合正態分布計量資料采用（±s）表示，執行t檢驗與方差分析，并且相關性分析選擇直線相關。以P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結 果

2.1 各組大鼠CVF、心肌組織Ⅰ型膠原蛋白比較 表1 示，與假手術組比較，模型組大鼠CVF 升高（P＜0.01）；以模型組為參考，心安顆粒組、卡托普利組大鼠CVF 均下降（均P＜0.01），且卡托普利組低于心安顆粒組（P＜0.01）。與假手術組比較，模型組大鼠Ⅰ型膠原蛋白升高（P＜0.01）；與模型組比較，心安顆粒組、卡托普利組大鼠Ⅰ型膠原蛋白均降低（均P＜0.01）；心安顆粒組與卡托普利組Ⅰ型膠原蛋白比較，差異無統計學意義（P＞0.05）。

表1 40只成年正常雄性SD大鼠假手術組、模型組、卡托普利組、心安顆粒組心肌膠原容積分數、心肌組織Ⅰ型膠原蛋白比較（± s）

表1 40只成年正常雄性SD大鼠假手術組、模型組、卡托普利組、心安顆粒組心肌膠原容積分數、心肌組織Ⅰ型膠原蛋白比較（± s）

注：與假手術組比較，aP＜0.01；與模型組比較，bP＜0.01；與卡托普利組對比，cP＜0.01

Ⅰ型膠原蛋白0.05±0.00 0.19±0.00a 0.11±0.00ab 0.12±0.00ab組別假手術組模型組卡托普利組心安顆粒組數量10 10 10 10心肌膠原容積分數（%）5.49±0.97 41.51±0.68a 15.71±0.85ab 23.19±1.47abc

2.2 心肌組織MMP-1、TIMP-1、MMP-1/TIMP-1 與假手術組比較，模型組MMP-1、TIMP-1、MMP-1/TIMP-1 均增高（均P＜0.05）；與模型組比較，心安顆粒組、卡托普利組MMP-1、TIMP-1、MMP-1/TIMP-1 均減?。ň鵓＜0.01）；心安顆粒組TIMP-1 蛋白表達高于卡托普利組（P＜0.05）。見表2。

表2 40只成年正常雄性SD大鼠假手術組、模型組、卡托普利組、心安顆粒組MMP-1、TIMP-1、MMP-1/TIMP-1比較（± s）

表2 40只成年正常雄性SD大鼠假手術組、模型組、卡托普利組、心安顆粒組MMP-1、TIMP-1、MMP-1/TIMP-1比較（± s）

注：MMP-1為基質金屬蛋白酶1；TIMP-1為基質金屬蛋白酶抑制劑1；與假手術組比較，aP＜0.01，bP＜0.05；與模型組比較，cP＜0.01

組別假手術組模型組卡托普利組心安顆粒組MMP-1/TIMP-1 0.76±0.05 0.74±0.47b 0.55±0.05c 0.68±0.05c數量10 10 10 10 MMP-1 0.08±0.05 0.23±0.07a 0.10±0.05c 0.13±0.03c TIMP-1 0.11±0.00 0.31±0.00a 0.18±0.01c 0.19±0.03bc

2.3 每組大鼠左心室肥厚指數比較與假手術組比較模型組大鼠HMI、LVMI 顯著增加（均P＜0.01）。與模型組比較，各給藥組大鼠HMI、LVMI 均有不同程度降低。見表3。

表3 40只成年正常雄性SD大鼠假手術組、模型組、卡托普利組、心安顆粒組HMI、LVMI比較（mg/g，± s）

表3 40只成年正常雄性SD大鼠假手術組、模型組、卡托普利組、心安顆粒組HMI、LVMI比較（mg/g，± s）

注：HMI 為心臟質量指數，LVMI 為左心室質量指數；與假手術組比較，aP＜0.01；與模型組比較，bP＜0.01

LVMI 2.16±0.13 2.70±0.17a 2.57±0.16b 2.43±0.17b組別假手術組模型組卡托普利組心安顆粒組數量10 10 10 10 HMI 2.89±0.16 3.67±0.21a 3.29±0.17b 3.35±0.29b

3 討 論

心安顆粒是由苦參、黃芪、麥冬、赤芍等組成的復方純中藥制劑?，F代藥理研究表明，麥冬能減少心肌耗氧量，增強心肌收縮力，改善心肌缺血狀態［1-2］。黃芪中的黃芪多糖成分具有調節機體免疫力、抗氧化、保護心血管等作用，而黃芪皂苷能清除氧自由基、提高心肌細胞抗缺氧的能力，從而改善心臟功能［3-5］。赤芍可增加冠狀動脈血流量，從而改善心肌缺血缺氧狀態。前期的相關工作中，就心安顆粒實施了很系統化與深入化的動物研究，最終結果顯示：這種制劑能夠顯著改變其心肌炎大鼠的心肌缺血表現，有抗炎、抗氧化以及抗心律失常效果，且調整免疫等多種辦法，對于心肌有很好的保護作用［6-9］。

急性心肌梗死后心室重構被視為心臟功能衰竭的發病機制之一，同時也是評估患者預后的重要因素。心肌纖維化是心室重構的關鍵點［10］。研究表明，65 歲以上女性心肌梗死患者5 年后心力衰竭的發生率為23%［11］，由此可見預防和逆轉心肌纖維化是有效預防或改善心肌梗死后心力衰竭表現，且改變預后、生存質量的重要方法。細胞外基質以及心肌細胞改變均會致使心室重構出現。如沉積增多或降解減少，均可直接導致纖維化病變的發生，并最終導致心室形態和功能異常。心肌中細胞外基質主要由Ⅰ型、Ⅲ型膠原組成，Ⅰ型膠原纖維粗大，伸展性和回彈性較小，抗拉強度高，決定著心肌舒張或收縮實際僵硬程度［3］。這次研究中的模型組Ⅰ型膠原蛋白水平增高，CVF 也表現為增高，膠原沉積增加，極易使得心室形態以及功能出現異常，以此誘發心肌重構，產生心肌纖維化問題。心安顆粒組、卡托普利組Ⅰ型膠原蛋白對比于模型組為降低，且CVF下降較多，以此保持著心肌膠原代謝處于穩定狀態，對抑制心室重構，逆轉心肌纖維化起到了關鍵性的作用。MMP-1 是以心肌間質Ⅰ、Ⅲ型膠原為底物的膠原降解酶，對降解細胞外基質起著最重要的作用。TIMP-1 是MMP-1 的天然特異性抑制劑，可以與活性MMP-1 不可逆結合，抑制其對間質膠原蛋白的降解。因此，MMP-1/TIMP-1 的比值保持平衡對于維持心肌膠原代謝的穩定起著十分重要的作用。MMP-1/TIMP-1 比例失衡是導致心肌重構的重要環節之一。本次研究結果所得，心安顆粒能夠控制調整MMP-1/TIMP-1，調控細胞外基質代謝，從而達到抑制心室重構，逆轉心肌纖維化的作用。

利益沖突：作者已申明文章無相關利益沖突。