莪術醋制對大鼠膽汁代謝的影響

顧薇　陸兔林　李金慈　王巧晗　潘自皓　季德　李林　張季　毛春芹

[摘要]通過考察莪術醋制前后對由肝臟分泌的膽汁中內源性代謝產物的影響，以期探討莪術醋制對膽汁內源性代謝物的影響。分別制備生、醋莪術醇提液及生理鹽水溶液，灌胃給藥05 h后做膽總管插管引流術收集12 h內大鼠膽汁；膽汁樣品1∶3乙腈沉淀蛋白后進行UPLCTOFMS分析；采用單維統計與多元統計相結合，PeakView軟件與網絡數據庫相比對的數據分析方法，鑒定潛在生物標記物。 醋制前后莪術提取物對大鼠膽汁代謝譜具顯著影響，鑒別出生、醋莪術給藥組的大鼠膽汁中具有顯著性差異的13個代謝物；再結合化合物網絡數據庫進行鑒定，得到8個代謝物；進一步把給藥組與空白組進行t檢驗單維統計分析，得到與空白組比較具顯著性差異的7個代謝物，推定此7個代謝物為生、醋莪術給藥后大鼠膽汁的潛在生物標記物，其中6個潛在生物標記物在醋品組中顯示上調，其與磷脂代謝、脂肪代謝、膽汁酸代謝及與調控N酰基乙醇胺水解反應平衡作用相關的代謝調控相關，提示通過大鼠膽汁內源性代謝物的差異探討莪術醋制增效的機制。

[關鍵詞]莪術；醋制；膽汁；代謝組學；UPLCTOFMS

[Abstract]To explore the effect of vinegarprocessed Curcumae Rhizoma on endogenous metabolites in bile by investigating the endogenous metabolites difference in bile before and after Curcumae Rhizoma was processed with vinegar Alcohol extracts of crude and vinegarprocessed Curcumae Rhizoma， as well as normal saline were prepared respectively， which were then given to the rats by intragastric administration for 05 h Then common bile duct intubation drainage was conducted to collect 12 h bile of the rats UPLCTOFMS analysis of bile samples was applied after 1∶3 acetonitrile protein precipitation； unidimensional statistics were combined with multivariate statistics and PeakView software was compared with network database to identify the potential biomarkers Vinegarprocessed Curcumae Rhizoma extracts had significant effects on metabolites spectrum in bile of the rats With the boundaries of P<005， 13 metabolites with significant differences were found in bile of crude and vinegarprocessed Curcumae Rhizoma groups， and 8 of them were identified when considering the network database Ttest unidimensional statistical analysis was applied between administration groups and blank group to obtain 7 metabolites with significant differences and identify them as potential biomarkers 6 of the potential biomarkers were upregulated in vinegarprocessed group， which were related to the metabolism regulation of phospholipid metabolism， fat metabolism， bile acid metabolism， and Nacylethanolamine hydrolysis reaction balance， indicating the mechanism of vinegarprocessed Curcumae Rhizoma on endogenous metabolites in bile of the rats

[Key words]Curcumae Rhizoma； vinegarprocessing； bile； metabolism； UPLCTOFMS

doi：10.4268/cjcmm20160726

中藥莪術為姜科植物蓬莪術Curcuma phaeocaulis Val，廣西莪術C kwangsiensis SG Lee et CFLiang或溫郁金C wenyujin YHChen et CLing的干燥根莖，莪術生品行氣消積力強，醋制后主入肝經血分，增強散瘀止痛作用。歷版《中國藥典》一部莪術炮制項下均收載醋莪術，莪術臨床方劑及中成藥均以醋莪術入藥，2010年版《中國藥典》收載了15種以醋制莪術入藥的成方制劑，其方解均注明莪術醋制后重入肝經。

莪術中主要含有揮發油、姜黃素類、微量元素及多糖等成分，其中揮發油類和姜黃素類是其有效成分群。揮發油在莪術中的質量分數約為1%～25%，為多種單萜類及倍半萜類化合物，其中主要生物活性成分為莪術醇（curcumol）、莪術二酮（curdione）、吉馬酮（germaerone）、β欖香烯（βelemene）和新姜黃二酮。姜黃素類化合物是莪術中的另一類重要成分，主要指二苯基庚烴類化合物，目前已分離并鑒定20多個姜黃素類化合物，其中以姜黃素（curcumin）、去甲氧基姜黃素（demethoxycurcumin）和雙去甲氧基姜黃素（bisdemethoxycurcumin）為主要活性成分[1]。

莪術具有較強行氣破血、活血化瘀之功，在抗纖維組織增生、抗腫瘤、抗血栓、抗菌抗病毒、抗炎等方面均有顯著功效。由莪術和紅花制成的靜脈注射劑莪紅注射液可治療缺血性心血管病[2]，莪術油葡萄糖注射液是1995年版《中國藥典》二部新收載的抗病毒藥。莪術中抗癌有效成分β欖香烯已被制成注射液使用。研究表明，莪術中主要的抗癌活性成分為姜黃素、β欖香烯、γ欖香烯、莪術醇、莪術酮、吉馬酮、異莪術烯醇等[3]，其均來源于莪術揮發油類及姜黃素類成分。

代謝組學最早由Nicholson等[4]提出，其關注于對限定條件下的特定生物樣品中所有內源性代謝產物的定性定量分析，并指示生物體對內源或外源刺激的代謝應答。將系統論指導下的代謝組學與中醫藥學的整體觀念相結合，可以使中醫藥學由經驗描述式的科學逐步轉變成定量描述和預測的科學，所以在中藥現代化研究中代謝組學已逐步應用于中藥歸經研究、中藥安全性評價、中藥復方研究等多個領域中。

膽汁為肝臟分泌的液體，主要參與脂肪的消化和吸收并將某些代謝產物從肝臟中排出；且肝與膽的關系很密切，病理上相互影響，治療上往往是肝膽同治。中醫理論認為，膽位于肝內，膽汁乃肝經之余氣而成，兩者一臟一腑表里相屬，有絡脈相連其經脈，皆行于脅肋。《靈樞·本臟》說：“肝合膽”。課題組經前期研究發現，莪術醋制后可以促進大鼠的膽汁分泌，其膽汁排泄總量與生莪術組相比具有顯著性差異，本文以膽汁為研究對象，從代謝的角度研究藥物對肝臟系統的擾動，采用超高效液相色譜飛行時間質譜（UPLCTOFMS）分析技術及統計學分析方法，研究生、醋莪術藥物作用后對膽汁中代謝物組的擾動，挖掘潛在的生物標記物，探索現代新技術在傳統中藥炮制理論研究中的應用。從膽汁代謝組學的視角探討醋制對中藥莪術的影響未見報道。

1材料

Ekspert ultraLC 100XL超高效液相系統，包括在線脫氣機、四元泵、自動進樣器、柱溫箱；AB Sciex TripleTOF 5600飛行時間質譜儀（美國AB Sciex公司），配有Analyst TF16工作站、PeakView分析軟件、MarkerView分析軟件等；FA1104型電子分析天平（上海精密科學儀器有限公司）；LDZ52型全自動離心機（北京醫用離心機廠）；KQ500B型超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）；MilliQ Gradient A10 超純水器 （Millipore，Bedford，MA，USA）；旋轉蒸發儀（瑞士Buchi）；渦旋振蕩混合器（上海滬西分析儀器廠）。

甲醇、乙腈為色譜純（德國Merck公司），水為超純水，其余試劑均為分析純；莪術，購自浙江，批號20120506，經南京中醫藥大學藥學院巢建國教授鑒定為溫郁金Cwenyujin的干燥根莖。

SPF級健康SD大鼠，雄性，體重280～320 g，由南京中醫藥大學實驗動物中心提供，許可證號SCXK（浙）20080033，實驗前于南京中醫藥大學實驗動物中心適應飼養1周，以適應本實驗室環境，給予標準光照周期（14 h光照、10 h黑夜），實驗室溫度維持20～25 ℃，相對濕度控制在70%左右。

2方法

21樣品制備

211生莪術及醋莪術的制備按照《中國藥典》莪術炮制項下規定進行制備生、醋莪術飲片。生莪術：取凈莪術，略泡，洗凈，蒸軟，切厚片，干燥制得生莪術飲片。醋莪術：取凈莪術加醋煮至透心，取出，稍涼，切厚片，干燥制得醋莪術飲片。

212生莪術及醋莪術提取液的制備中藥水提液中以多糖類物質為主，而本文研究對象為莪術中活性成分揮發油類和姜黃素類，其均為脂溶性成分，故采取醇提法進行提取，具體提取方法如下：取適量生莪術或醋莪術，粉碎后提取3次，用15倍量的90%乙醇加熱回流1 h，藥渣再加6倍量60%乙醇加熱回流1 h，藥渣繼續加6倍量40%乙醇加熱回流1 h，合并以上3次提取液，過濾后40 ℃減壓濃縮使得生藥量提取液終濃度為14 g·mL-l，4 ℃保存。

22分組與給藥

實驗分成空白組（Control）、生莪術組（RRC）、醋莪術組（VRC），每組5只，實驗開始前12 h禁食，自由飲水。生、醋莪術組分別灌胃給予生、醋莪術藥液1417 g·kg-1，空白組灌胃等量的生理鹽水溶液。

23大鼠膽汁采集

于給藥05 h后腹腔注射10%水合氯醛（3 mL·kg-1）麻醉后，迅速打開腹腔，仰位固定，做膽總管插管引流術，并以生理鹽水紗布覆蓋腹部。插管成功后，收集12 h內大鼠膽汁，-80 ℃冰箱保存備用。

24大鼠膽汁前處理

取各膽汁樣品1 mL，加3倍量乙腈，渦旋3 min，12 000 r·min-1離心10 min，取上清液35 ℃氮氣吹干，殘渣以10 μL甲醇復溶，再次12 000 r·min-1離心，取上清液。

25UPLCTOFMS分析

251色譜條件Agilent Zorbax SBC18色譜柱（21 mm×50 mm，18 μm）；流動相乙腈（A）01%甲酸水（B），梯度洗脫，0～5 min，5%～35%A，5～10 min，35%～50%A，10～20 min，50%～65%A，20～25 min，65%～100%A，25～28 min，100%A，流速04 mL·min-1，進樣量2 μL，柱溫30 ℃，運行30 min。

252TOFMS質譜條件采用ESI離子源，正離子模式下采集信號。DuoSpray離子源，源參數設置如下：噴霧電壓（ion voltage）5 500 V，解簇電壓（declustering potential）60 V，離子源溫度（sorce temperature）550 ℃，氣簾氣（curtain gas）35 Pa，Gas1（nebulizer gas）55 Pa，Gas2（heater gas）65 Pa；采用MS/MS二級質譜掃描模式，質量數掃描范圍m/z 100～1 000；動態背景扣除。

253數據分析樣品UPLCTOFMS圖譜及數據導入MarkerView軟件進行PCA多元統計分析并進行t檢驗單維統計分析得到差異代謝產物，進而采用AB Sciex的PeakView軟件對差異代謝產物的色譜峰進行識別和峰匹配，對照標準譜圖鑒定潛在生物標記物種類，最后與空白組進行t檢驗單維統計分析排除掉給藥前后不發生顯著變化的代謝物，最終確認潛在生物標記物。

3結果

31膽汁樣品UPLCTOFMS總離子流圖

各組大鼠的膽汁樣品UPLCTOFMS總離子流圖見圖1。經直觀分析，各組大鼠膽汁代謝物譜有明顯的不同。在本實驗條件下，22～26 min有大量的物質被洗脫出，生、醋莪術代謝物譜的組間差異還需進一步分析。

32主成分分析

為了使樣本的分析結果更加直觀，首先采用主成分分析進行LCMS復雜數據的降維處理，以便直觀區分各組樣本差異。將空白組、生莪術組和醋莪術組膽汁代謝物的UPLCTOFMS原始圖譜及數據導入MarkerView軟件進行主成分分析（PCA分析）并進行降維處理，繪制反映組間離散程度的Score Scatter Plot散點圖見圖2，任一點表示一個對應的樣本，可以發現給藥組與空白組間的代謝輪廓呈分離趨勢，提示給藥組與空白組的代謝譜存在組間差異；從圖2中看出，醋品組，同時生、醋莪術組之間的代謝輪廓也呈分離趨勢，提示2組代謝物譜存在差異。

33生、醋莪術膽汁代謝物組間差異代謝物的探尋

生物標記物是能夠代表性反映生物體的生理病理變化或外界環境刺激的內源性物質。為了進一步明確生、醋莪術膽汁代謝物的組間差異及尋找具有顯著性差異的生物標志物，采用單維統計分析（獨立樣本t檢驗）對組間數據進行統計學分析，鑒別出生、醋組間具有顯著性差異的13個代謝物（P<005），提取相應離子峰進行比對，各成分按順序排列為潛在生物標記物，見表1。

34生、醋莪術膽汁代謝物組間差異代謝物的鑒定

從生、醋組膽汁樣品UPLCTOFMS總離子流圖中根據表1羅列的13個差異代謝產物的m/z提取相應離子峰進行比對，采用AB Sciex的PeakView軟件進行峰識別，對照METLIN，HMDB等化合物網絡數據庫，以誤差小于10 ppm為界，綜合分析鑒定了其中的8個潛在生物標記物，見表2。M2～M4，M6～M10及M12（M8，M9為同一物質），均為脂肪代謝過程中的相關物質，提示莪術醋制后對機體的脂質代謝過程產生了重要影響，但這些生物標記物的結構確認有待進一步研究。

35空白組與生、醋莪術組的差異代謝物分析

根據表2中8個潛在生物標記物的m/z，從樣品UPLCTOFMS總離子流圖中提取相應離子峰，進行生品組與空白組、醋品組與空白組的兩兩比對（由于M8與M9為同一物質，故分析時此2組強度相加），采用單維統計分析（獨立樣本t檢驗）對組間數據進行統計學分析，鑒別出空白組與生品組組間、空白組與醋品組組間具有顯著性差異的代謝物（P<005）和不具統計學差異的代謝物，見圖3。由圖3可知，M2代謝物在給藥組與空白組間均無顯著性差異，即此代謝物在給藥組與空白組間無差異，故排除M2為潛在生物標記物；其他7個已鑒定的生、醋莪術組差異代謝物中5個與空白組比較均具顯著性差異，M8與M10代謝物顯示空白組僅與其中一組給藥組具顯著性差異。由此確定M3，M4，M6，M7，M8（含M9），M10，M12 7個代謝物為生、醋莪術給藥后的潛在生物標記物。

36代謝通路分析

本實驗鑒定出的7種潛在生物標記物的主要代謝通路和生物功能見表3，可知這些潛在生物標記物主要與機體的脂質代謝途徑相關，包括磷脂代謝、膽汁酸代謝和脂肪轉化過程。由此推測莪術醋制后可能通過調控脂質代謝過程，促進脂肪轉化，提高機體抗氧化能力而達到增強散瘀止痛的功效，其具體作用機制與信號通道需進一步研究。

4討論

中藥經炮制增效，效應的變化與炮制后化學成分改變有密切聯系，而中藥多成分難以其直接闡明；代謝組學可以從藥物經體內代謝和藥效作用后的生物標記物入手，通過分析不同狀態下生物標記物的變化規律，探討中藥效應。本文基于UPLCTOFMS的代謝組學方法，采用單維統計與多元統計相結合，PeakView軟件與網絡數據庫相比對的數據分析方法，分析醋制前后莪術提取物對大鼠膽汁代謝譜的影響，鑒定得7種潛在生物標記物（表3），并對其參與的代謝通路進行分析。

41磷脂代謝相關的潛在生物標記物

化合物M6，M4，M12分別被鑒定為溶血磷脂酰膽堿（lysophosphatidylcholine，lysoPC）、磷脂酰乙醇胺（phosphatidylethanolamine，PE）和磷脂酰肌醇（phosphatidylinositol，PI）。

大鼠給予醋莪術提取液后，體內LPC呈降低趨勢，PE和PI呈升高趨勢，這3種化合物均為體內內源性磷脂類成分，lysoPC是低密度脂蛋白的主要成分，被認為是影響血管內皮功能的重要因素之一，在動脈粥樣硬化和炎癥疾病中有重要作用。一般而言，它在細胞或組織中含量很少，如果濃度過高則會對細胞的膜系統造成傷害[5]。PE是甘油磷脂之一，是構成生物膜脂雙層的基本骨架，王亮等[6]發現肝源性PE對肝癌細胞的生長具有明顯的抑制作用，且能誘導其發生凋亡。PI是第二信使的前體，其4，5位羥基被磷酸化生成的磷脂酰肌醇4，5二磷酸（phosphatidylinositol 4，5bisphosphate，PIP2）是細胞膜磷脂的重要組成，主要存在于細胞膜的內層。在激素等刺激下可被裂解為甘油二酯和三磷酸肌醇（inositol triphosphate，IP3），均為胞內傳遞刺激信號至細胞核的胞內第二信使。由此推測，莪術醋制后可以下調lysoPC的水平，上調PE和PI水平，調控機體的磷脂代謝，從而產生優于生莪術的療效，起到“醋制入肝經”的效果。

42膽汁酸代謝相關的潛在生物標記物

化合物M8和M9被鑒定為牛磺鵝去氧膽酸（tauroursodeoxycholic acid，TCDCA），化合物M8和M9為TCDCA的不同加合離子峰，TCDCA為膽汁酸的重要組成成分。膽汁酸是膽汁中的一類膽烷酸的總稱，按結構分為游離型和結合型，其中結合型膽汁酸是一類重要的生命物質，對脂肪代謝和調節膽固醇、磷脂、膽紅素的溶解平衡及穩定起著重要作用[7]。與生莪術組相比，醋莪術組膽汁中的TCDCA量呈升高趨勢，且由于牛磺鵝去氧膽酸在生品中未見與空白組的差異，提示莪術醋制后可調節膽汁酸的代謝從而達到入肝經的效果。

43與調控N酰基乙醇胺水解反應平衡作用相關的潛在生物標記物

化合物M3鑒定為Ncyclohexanecarbonylpenta decylamine NcyclohexanecarbonylpentadecylamineN cyclohexanecarbonylpentadecylamine是體內N脂肪酰基乙醇胺水解酶（Nacylethanolaminehydrolyzing acid amidase，NAAA）的選擇性抑制劑[8]。NAAA是一類與酸性神經酰胺結構和功能相類似的水解酶，主要存在于溶酶體中，在巨噬細胞中有較高的表達，能夠將脂肪酸鏈長度為C12～C20的N酰基乙醇胺（Nacylethanolamines，NAEs）水解為相應的脂肪酸和乙醇胺，從而抑制乙醇胺在體內生物活性的發揮。如N花生四烯酰乙醇胺（anandamide，AEA）儲存與肝臟中，對于各種肝病均有潛在的治療作用；棕櫚酸乙醇胺（Npalmitoylethanolamine，PEA）是一類重要的鎮痛、抗炎和神經保護物質。本實驗發現醋莪術組大鼠膽汁中NAAA的選擇性抑制劑含量始終高于生莪術組，提示莪術醋制后可能具有調控N酰基乙醇胺水解反應平衡的作用。

44與脂肪代謝相關的潛在生物標記物

化合物M7，M10分別被鑒定為deterrol stearate，人參環氧炔醇酯（panaxydol linoleate）。

deterrol stearate及panaxydol linoleate均為體內脂肪酸代謝途徑中的化合物，醋制后呈現不同程度的升高，提示莪術醋制前后可能對機體脂質代謝途徑產生了重要影響。

由以上結果可知，與生莪術組相比，醋莪術組大鼠膽汁中內源性代謝物中涉及到脂質代謝過程的標記物的量增加，提示醋制莪術組脂質代謝強于生莪術組，二者效應存在差異，代謝物組學可用于探討炮制對中藥效應的影響研究。

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[責任編輯曹陽陽]