瓊玉膏延緩衰老作用的候選靶蛋白分析

曲衛玲　曹媛　劉煥蘭　童玲　范睿　劉榮福

[摘要]采用iTRAQ技術研究瓊玉膏干預衰老大鼠模型的下丘腦蛋白，尋找候選靶蛋白，探索瓊玉膏延緩衰老的作用機制。結果表明，瓊玉膏可以提高大鼠血清GSHPx及肝臟SOD活力。iTRAQ技術鑒定到的總蛋白為3 522個，FDR<1%。通過數據分析，鑒定出瓊玉膏組與模型組比較，具有295種差異蛋白；模型組與空白組比較，具有20種差異蛋白；其中與空白組相比，模型組中下調而瓊玉膏組中上調的蛋白有14種。在瓊玉膏組和模型組的295種差異蛋白中，差異倍數≥130的差異蛋白有40種，最高為147。查閱文獻及基因功能檢索，篩選出瓊玉膏延緩衰老的候選靶蛋白12種：ST18，Ptprc，PSMB8，INPP4B，Shc3，Pik3r1，PIP5K1C，Nampt，Rasgrp2，Asah2，Pdpk1，Map2k7。Western blot法檢測下丘腦炎癥通路NFκB蛋白，模型組（096）相對空白組（085）表達量升高；而瓊玉膏組（089）相對模型組則下降。QPCR檢測PIP5K1C，Ptprc等與炎癥相關的候選靶蛋白，與空白組相比，模型組中mRNA相對表達量顯著下降（P<001），而瓊玉膏組中則顯著升高（P<001），與蛋白質組學數據分析一致。瓊玉膏可能通過調節下丘腦炎性反應而延緩衰老的發生。

[關鍵詞]瓊玉膏；延緩衰老；候選靶蛋白；下丘腦；iTRAQ；NFκB

[Abstract]To explore the associated proteins of the hypothalamus in aging rat models with intervention by Qiongyugao（QYG） based on iTRAQ technology， find out the target protein candidates and investigate the mechanism of delaying aging for Qiongyugao The results showed that Qiongyugao increased GSHPx activity in serum and SOD activity in liver； the total protein count identified by iTRAQ was 3 522， FDR<1% There were 20 kinds of differential proteins between the blank group and model group； there were 295 kinds of differential proteins between model group and QYG group， and 40 kinds of them had a difference multiple ≥130 （the maximum value was 147） Compared with blank group， there were 14 kinds of proteins that were downregulated in model group and upregulated in QYG group Combined with literature search and gene function search， 12 kinds of target protein candidates were screened out ： ST18， Ptprc， PSMB8， INPP4B， Shc3， Pik3r1， PIP5K1C， Nampt， Rasgrp2， Asah2， Pdpk1， and Map2k7 The expression of nuclear factorkappa B （NFκB） in the hypothalamic inflammatory pathway was detected by Western blot and the results showed that its expression level in model group（096） was higher than that in control group（085）， while its expression level in QYG group（089） was lower than that in model group QPCR results showed that the relative mRNA expression levels of PIP5K1C and Ptprc in model group were significantly lower than those in blank group（P<001）； while compared with the model group， the mRNA expression levels of PIP5K1C and Ptprc in QYG group were significantly increased（P<001） This result was consistent with proteomics data QYG may delay aging by regulating hypothalamic inflammatory reaction

[Key words]Qiongyugao（QYG）； antiaging； target protein candidates； hypothalamus； iTRAQ； NFκB

doi：10.4268/cjcmm20160724

瓊玉膏作為一劑經典養生方，曾被清宮皇帝作為日用養生品服用；現今應用瓊玉膏治療虛勞、癌癥的效果也得到認可。瓊玉膏組方簡單，僅生地、人參、茯苓和蜂蜜4味，但配伍精良，補陰而不忘扶陽、益氣而不忘育陰，既可治病也可養生，有良好的改善免疫、延緩衰老的作用。但是目前關于瓊玉膏的作用機制少有研究，本課題研究希望能有助于闡明瓊玉膏延緩衰老機制，有利于瓊玉膏的研發和應用。

1材料

雄性SD大鼠，42只，日齡180～200 d，由廣州中醫藥大學實驗動物中心提供，合格證號SCXK（粵）20130034。

自制瓊玉膏（蜂蜜，北京同仁堂有限公司；生地黃，產地河南，北京冠城藥業有限公司；人參，產地吉林，北京同仁堂有限公司；茯苓，產地云南，廣東眾康中藥飲片有限公司）； D半乳糖（美國Amresco公司）；尿素（美國GibcoBRL公司，01M00491V）；二硫素糖醇（美國Promega公司，R21041092）；碘乙酰胺IAA（美國Promega公司，NI174659）；測序級胰蛋白酶Trypsin（美國Promega公司，0000142423）；SDS（美國Sigma公司，L5750）；三氟乙酸TFA（美國Sigma公司，A0329207）；TMT 6標試劑盒（美國Thermo Scientific公司，PL208420）；蛋白酶抑制劑（瑞士Roche公司，10061200）；三乙基碳酸氫銨TEAB（巴拉圭圣克魯斯公司，NH174658）；高純總RNA快速提取試劑盒（離心柱型）（RP1201），Recombinant DNase I （RNasefree）（2270A），Recombinant Ribonuclease Inhibitor（2313A），Oligo d（T）18 Primer（3806），Random Primer [Hexadeoxyribonucleotide mixture；pd（N）6]（3801），Reverse Transcriptase MMLV（RNase H）（2641A），dNTP Mixture（T4019）均來自日本takara公司；SYBR GREEN（日本ToYoBo公司，QPK201）；PMSF（100 mmol，碧云天生物技術，ST506）；RIPA裂解液（碧云天生物技術，P0013B）；pageruler prestained protein ladde（美國賽默飛公司，26619）；βACTIN抗體肌動蛋白（BM0627）；羊抗兔IgG HRP（BA1054）均來自博士德公司；丙烯酰胺Acrylamide（0341），N，N亞甲基甲叉雙丙烯酰胺（methylenebisacrylamide，110269），Tris Base（0497），SDS（L5750），過硫酸銨（ammonium peroxodisulfate，0488），甘氨酸（glycine，0167），聚氧乙烯失水山梨醇單月桂酸酯（吐溫20，Tween20，0777）均來自美國Amresco公司。

冷凍離心機（珠海黑馬醫學儀器有限公司）；HClass超高壓液相色譜和NanoAcuity超高壓納升級液相色譜（Waters公司）；Q Exative質譜儀（Thermo Scientific公司）；UMAX Powerlook 2100XLUSB掃描儀；IKA振蕩器；恒溫加熱塊（鼎國昌盛生物技術有限公司）；冷凍臺式離心機（eppendorf centrifuge 5417R型）；LX100手掌式離心機（其林貝爾儀器）；電熱恒溫水浴鍋（長安科學儀器）；A100PCR儀（Long Gene）；GelDoc XR凝膠成像系統（BioRAD）；JY200C電泳儀（北京君意東方電泳設備有限公司）；7S2脫色搖床（海門市其林貝爾儀器制造有限公司）；5200凝膠成像系統（Tanon）。

2方法

21動物分組及造模方法

6～7月齡健康雄性SD大鼠，按隨機數字表法分為3組：空白對照組、衰老模型組和瓊玉膏給藥組，每組14只。除空白組外，其余2組每天腹腔注射D半乳糖300 mg·kg-1，連續造模6周，空白對照組腹腔注射等劑量生理鹽水。同時，瓊玉膏給藥組每天灌胃瓊玉膏0005 83 mL·g-1，衰老模型組和空白對照組灌胃等劑量生理鹽水。給藥結束后，腹主動脈取血（3組各取到9例），取肝臟組織（模型組取到7例，其余2組9例），進行抗氧化活性測試。

22同位素相對標記與絕對定量（iTRAQ）

3組實驗動物取下丘腦，每組2個生物學重復，共計6個樣本，進行12標iTRAQ蛋白組檢測分析：①提取蛋白質并定量；②蛋白質酶解；③肽段標記；④標記肽段除鹽；⑤高pH反向液相色譜對標記肽段進行分離；⑥對標記肽段進行質譜檢測；⑦基于質譜的定性定量分析。

23QPCR驗證

檢測BLAB/c nu/nu下丘腦對差異蛋白表達量的關系，每組4個樣本重復：①引物設計；②總RNA的提取與檢測；③逆轉錄（RT）；④QPCR反應體系；⑤跑膠驗證。

24Western blot驗證

檢測BLAB/c nu/nu下丘腦差異蛋白的表達情況，每組3個樣本重復：①蛋白提取與含量測定；②電泳；③轉膜；④封閉、孵育；⑤顯影；⑥灰度檢測。

25統計學處理方法

采用SPSS 190統計軟件，數據均以±s表示，用單因素方差分析，t檢驗等進行組間比較。

3結果

31衰老模型評價

大鼠出現毛色枯槁無光、皮膚彈性差、精神萎靡、倦怠嗜睡、明顯減少進食、形體瘦弱、行動遲緩等衰老體征；取血清和肝臟組織進行抗氧化能力測試。

311血清谷胱甘肽過氧化物酶（GSHPx）檢測與空白組比較，模型組大鼠血清GSHPx活力值明顯下降，而瓊玉膏組可以提升其活力值（但未及空白組水平），具有統計學意義，見表1。

因此，從模型組的動物形態學觀察及血清GSHPx，肝臟SOD活力均呈下降趨勢來看，衰老模型造模成功，且初步判斷瓊玉膏具有抗氧化性。

32差異表達蛋白

比較空白組、瓊玉膏組和模型組中下丘腦蛋白質含量，2組樣本中各個蛋白表達量的比值，大于12或者小于083就認為是差異蛋白，采用分組t檢驗，P<005為有統計學意義。鑒定出瓊玉膏組與模型組比較，具有295種差異蛋白；瓊玉膏組與空白組比較，具有96種差異蛋白；模型組與空白組比較，具有20種差異蛋白。

與空白組相比，在模型組中下降而瓊玉膏組可以上調的差異蛋白共有14個：細胞色素c氧化酶多肽VIc2（Cox6c2），中性神經酰胺酶（Asah2），植烷酸輔酶A 羥化酶相互作用類蛋白（Phyhipl），尼克酰胺磷酸核糖轉移酶（Nampt），尾錨定蛋白插入受體WRB（Wrb ），O甘露糖β1，4N乙酰葡糖胺基轉移酶（Pomgnt2），信號轉導子和轉錄激活子（Stat5b），脂酰CoA合成酶（Aacs），特定微管伴侶蛋白E（Tbce），3磷酸肌醇依賴的蛋白激酶1（Pdpk1），雙特異性作用蛋白激酶7（Map2k7），RAS脒基釋放蛋白2（Rasgrp2），SHC轉運蛋白（Shc3），細胞周期素G蛋白（Gak）。

對瓊玉膏組與模型組相比的295種差異蛋白中進一步篩選，差異倍數≥130的差異蛋白有40種（最高為147）。

結合文獻及基因功能檢索，對上述結果進行分析，篩選出與衰老可能相關的差異蛋白，見表3。

33WB檢測

運用WB法檢測衰老相關通路NFκB蛋白表達量情況，光密度測定結果見表4，圖1，2。與空白組比較，模型組NFκB通路被激活，蛋白表達量升高；與模型組比較，瓊玉膏組NFκB蛋白的表達量降低。

34QPCR檢測

QPCR檢測BLAB/c nu/nu下丘腦PIP5K1C，Ptprc mRNA表達量，見圖3。從電泳圖可以看出提取的RNA含量合格，沒有被污染。

通過計算結果顯示，運用瓊玉膏后PIP5K1C，Ptprc mRNA相對表達量有差異。經兩樣本t檢驗，與空白組相比，模型組中PIP5K1C mRNA相對表達量顯著下降（P<001），而瓊玉膏組中PIP5K1C mRNA相對表達量顯著升高（P<001）；同樣，與空白組相比，模型組中Ptprc mRNA相對表達量顯著下降（P<001），而瓊玉膏組中Ptprc mRNA相對表達量升高（P<001），見表5，圖4。通過凝膠電泳驗證，PCR引物設計方案設計出結果與實際實驗結果一致。

4討論

衰老原因非常復雜，涉及面廣，有關衰老的學

41瓊玉膏對D半乳糖致衰大鼠的抗氧化能力

機體對自由基的清除能力是目前運用較多的評價衰老的指標。本課題對實驗大鼠抗氧化能力研究表明，瓊玉膏可以提高大鼠血清谷胱甘肽過氧化物酶（GSHPx）及肝臟超氧化物歧化酶（SOD）活力，從而提升總抗氧化能力，清除自由基，延緩衰老。

42瓊玉膏延緩衰老的候選靶蛋白篩選

綜合比較空白組、模型組和瓊玉膏組的下丘腦蛋白，結合查閱相關研究文獻及基因功能，進一步篩選出12種與衰老相關的差異蛋白：腫瘤抑制蛋白18（ST18）、酪氨酸激酶C型受體（Ptprc）、低相對分子質量蛋白7抗體（PSMB8）、Ⅱ型多磷酸肌醇4磷酸酶（INPP4B）、SHC轉運蛋白（Shc3）、磷酸化磷脂酰肌醇激酶（Pik3r1）、磷脂酰肌醇4磷酸5激酶（PIP5K1C）、尼克酰胺磷酸核糖轉移酶（Nampt）、RAS脒基釋放蛋白2（Rasgrp2）、中性神經酰胺酶（Asah2）、3磷酸肌醇依賴的蛋白激酶1（Pdpk1）、雙特異性作用蛋白激酶7（Map2k7）。這些差異蛋白與代謝、細胞生長分化、信號轉導等有關，多參與影響細胞凋亡與細胞周期、炎癥反應、腫瘤發生等通路[25]，與衰老相關。

43瓊玉膏延緩衰老的炎癥通路機制

通過QPCR驗證篩選差異蛋白中的PIP5K1C，Ptprc發現，與空白組相比，2個差異蛋白均在模型組中下調，而在瓊玉膏組中又有上調趨勢，這與蛋白質組學數據分析結果一致。PIP5K1是細胞內產生磷脂肌醇PIP2的重要蛋白，參與多種細胞生物學功能，研究人員發現該蛋白在中性粒細胞遷移中起重要作用：缺失PIP5K1C的中性粒細胞穿過血管壁到達炎癥部位的能力明顯下降[6]。Ptprc是類風濕性關節炎的遺傳生物標志[7]。有研究資料表明，ST18，Nampt等也能夠調節免疫功能及促進炎癥反應[89]。半乳糖誘導PIP5K1C，Ptprc等蛋白表達異常，引起機體氧化應激及炎癥反應，促進炎癥通路NFκB發生改變。NFκB是機體防御反應、組織損傷和應激的相關通路，是機體內炎癥激活的標志。近年有研究表明，下丘腦NFκB通路炎癥是導致衰老的重要原因[10]。而瓊玉膏可以糾正差異蛋白異常表達量，調節NFκB通路。

因此，課題組將在此研究基礎上，進一步對其他候選靶蛋白進行篩選，并通過動物實驗及細胞水平實驗研究瓊玉膏改變下丘腦炎性衰老的具體機制。

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[責任編輯曹陽陽]