氧化苦參堿對H2狾2誘導L02細胞損傷的抑制作用及其機制的研究

韓延忠　周永峰　桑秀秀　劉慧敏　崔鶴蓉　孟雅坤　李光全　賀蘭芝　尹萍　王伽伯　柏兆方　肖小河

[摘要]該文研究氧化苦參堿（oxymatrine，OMT）抑制H2O2誘導的L02細胞損傷的作用及其機制。以人正常肝實質細胞L02為研究對象，采用H2O2誘導氧化應激建立肝損傷模型進行實驗，通過CCK8檢測OMT對L02細胞活性的影響；CSFE熒光實驗檢測OMT對L02細胞增殖的影響；流式細胞術檢測OMT對H2O2誘導的L02細胞凋亡率的影響；DCFHDA熒光探針檢測OMT對H2O2誘導的L02細胞內ROS含量；微板比色法檢測OMT對GSHPX和SOD活性的影響。結果顯示，OMT在625～100 mg·L-1通過誘導NADPH的產生，增強L02細胞內GSHPX酶和SOD酶的活性，進而促進GSH介導的活性氧ROS的清除，從而抑制H2O2誘導的L02細胞凋亡的發(fā)生，達到抑制H2O2誘導L02細胞損傷的作用。

[關鍵詞] 山豆根；氧化苦參堿；H2O2；氧化應激；過氧化物酶

[Abstract]To investigate the protective effects of oxymatrine （OMT） against H2O2induced damage in L02 cells and research the mechanism，L02 cells were used as the research object. The oxidative stress model of L02 was established by hydrogen peroxide （H2O2） CCK8 was used to detect the cell activation of L02 cells treated by different OMT FCM （flow cytometry） assay was used to evaluate the cell proliferation of L02 cells treated by OMT The apoptosis of L02 cells was detected using AnnexinV/7AAD apoptosis detection kit The level of ROS was detected by DCFHDA fluorescence probe The GSHPX and SOD were detected by micro plate and colorimetric method Results showed that when the concentration of OMT is between 625 and 100 mg·L-1， it could promote the production of NADPH and strengthen the activity of GSHPX and SOD to get rid of the ROS to protect the L02 cell from the apoptosis of L02 cell induced by H2O2

[Key words]Subprostrate sophora； oxymatrine； H2O2； oxydatve stress； peroxydase

doi：10.4268/cjcmm20160723

近年來肝病發(fā)生率的逐年上升已引起社會的廣泛關注，是我國目前較為嚴重的公共衛(wèi)生問題之一。肝病的發(fā)生必然會引起肝實質細胞的損傷，而活性氧引發(fā)的氧化應激又是多種肝病發(fā)生的病理基礎[1]，如脂肪肝、酒精肝、病毒性肝炎、肝纖維化等[25]，因此氧化應激在肝病發(fā)生發(fā)展中的作用不容小覷。山豆根為豆科植物越南槐Sophora tonkinensis Gapnep的干燥根和根莖，是一種清熱解毒類中藥，苦參堿類物質是山豆根的主要化學成分之一[6]。研究發(fā)現(xiàn)，苦參堿類成分具有良好的保肝降酶作用，能防止多種原因引起的肝損傷，例如氧化苦參堿可以抑制四氯化碳引起的化學性肝損傷[7]、爆發(fā)性肝損傷[8]、缺血再灌注肝損傷[9]、病毒性肝損傷[10]。而上述各種類型的肝損傷各種機制間相互影響，錯綜復雜。例如國際上公認的脂肪肝發(fā)病機制“二次打擊學說”：是指在氧化應激和免疫細胞因子2個方面共同作用，相互影響下，引起脂肪性肝炎，進而發(fā)展成肝纖維化和肝硬化的過程[1]。近年來氧化苦參堿保肝作用的研究主要側重于其免疫調節(jié)作用，抗氧化保肝作用的報道較少。本研究通過建立H2O2誘導的L02細胞氧化應激肝細胞損傷模型，研究氧化苦參堿的抗氧化作用及其保護機制，為深入研究其在多種肝病治療上的應用提供依據(jù)。

1材料

正常人肝細胞株L02細胞購自江陰康眾康民生物醫(yī)藥技術有限公司。用含10%胎牛血清的DMEM完全培養(yǎng)基在37 ℃，5% CO2且飽和濕度條件下進行常規(guī)培養(yǎng)。

DMEM完全培養(yǎng)基購自Hyclone公司；胎牛血清、胰蛋白酶、青霉素和鏈霉素均購自GIBCO公司；過氧化氫（H2O2）購自Sigma公司；Cell Counting Kit8（CCK8）購自東仁化學科技（上海）有限公司；ANNEXINⅤFITC/7AAD apoptosis detection kit購自美國貝克曼公司；CFSE Cell Division Tracker Kit購自Biolegend公司；氧化苦參堿（OMT）購自中國食品藥品檢定研究院；超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）活性檢測試劑盒、活性氧檢測試劑盒（reactive oxygen species kit）、BCA蛋白濃度檢測試劑盒（BCA protein assay kit）、谷胱甘肽過氧化物酶檢測試劑盒（cellular glutathione peroxidase assay kit）均購自碧云天生物技術公司。

酶標儀（BioTek Synergy H1 H1MFD， 美國）；二氧化碳培養(yǎng)箱（NAPCO Model 5410，美國）；臺式低速離心機（TD5A，湖南赫西儀器裝備有限公司）；流式細胞儀（BD FACS Canto Ⅱ）。

2方法

21L02細胞的培養(yǎng)L02細胞培養(yǎng)按照常規(guī)培養(yǎng)的方法，含10%胎牛血清、100 kU·L-1青霉素和100 g·L-1鏈霉素的高糖培養(yǎng)基 DMEM，37 ℃，5% CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)。

22CCK8檢測OMT對L02細胞活性的影響為了排除OMT對L02細胞毒性的劑量范圍，將L02細胞以70×104個/mL接種到96孔板，每孔100 μL，接種12 h細胞全部貼壁后，分別給質量濃度為3 200，1 600，800，400，200，100，50，25，125，625，312，156 mg·L-1的OMT， 實驗設陰性對照孔和空白對照孔，且每個濃度下設5個復孔，24 h后CCK8檢測L02細胞的增值率。細胞增值率=（As-Ac）/（Ac-Ab）×100%，式中Ac為對照孔吸光度；As為實驗孔吸光度；Ab為空白孔吸光度。

23CSFE染色法檢測OMT對L02細胞增殖的影響采用CSFE 染色法對L02細胞進行染色，染色過程嚴格按照說明書進行。將L02 細胞以10×105個/mL接種到12孔板中，每孔1 mL ， 接種12 h后分別給質量濃度為50，25，125，625 mg·L-1的OMT對L02細胞刺激，每個濃度下設3個復孔。24 h消化細胞，將消化下來的細胞進行流式檢測。

24L02細胞氧化應激模型的建立將濃度為70×104個/mL的L02細胞接種到96孔板，每孔100 μL， 接種12 h細胞全部貼壁后，設08，07，06，05，04，03，02，01 mmol·L-1濃度梯度的H2O2進行造模，實驗設陰性對照孔和空白對照孔，且每個濃度下設5個復孔，分別在造模05，1，2，3，4 h后用PBS清洗2遍，再用CCK8檢測L02細胞的存活率。實驗重復3遍。細胞的存活率=（As-Ab）/（Ac-Ab）×100%。

25ANNEXINFITC/7AAD法檢測凋亡細胞雙氧水建立氧化損傷模型，可以增加胞內ROS水平，進而發(fā)生胞內氧化應激反應，最終導致細胞的程序性死亡，即凋亡[15]，因此本實驗直接采用流式方法檢測細胞凋亡來證明OMT的抗氧化作用。將L02細胞按照10×105個/mL接種到12孔板中，設空白組、模型組和給藥組，每孔2 mL，接種12 h后，模型組和給藥組分別按照24項下造模條件造模，05 h后，給藥組分別給質量濃度為50，25，125，625 mg·L-1的OMT對L02細胞刺激，給藥24 h后，將L02細胞消化下來，按照ANNEXINⅤFITC/7AAD說明書方法進行流式檢測L02細胞凋亡情況。

26L02細胞內SOD，GSHPX活力測定用6孔板培養(yǎng)L02細胞，分組、造模、給藥如前，最后每孔加200 mL PBS，反復凍融法裂解細胞，然后1萬r·min-1離心10 min，取上清，按照試劑盒說明書測定吸光度（A），并計算SOD，GSHPX活力。

27L02細胞內ROS含量測定用12孔板培養(yǎng)L02細胞，分組、造模、給藥如前，最后清洗細胞，按照試劑盒說明書運用原位裝載探針的方法進行胞內染色，染色20 min，用PBS清洗3次，完畢用胰酶消化，加完全培養(yǎng)基終止消化，1 500 r·min-1離心，棄上清，最終用200 μL的PBS重懸。在激發(fā)波長488 nm，發(fā)射波長525 nm下進行流式檢測胞內熒光強度。

28統(tǒng)計分析采用SPSS 200統(tǒng)計軟件進行處理，組間差異采用t檢驗進行處理，P<005表示差異具有統(tǒng)計學意義。

3結果

31CCK8檢測OMT對L02細胞活性的影響OMT作用于L02細胞24 h后，OMT質量濃度在32～100 mg·L-1時增強L02細胞活性，并且在125 mg·L-1時對L02細胞活性最強；OMT質量濃度在400～3 200 mg·L-1時對L02細胞有毒性作用，并且隨著OMT濃度的增加毒性作用增強（圖1）?；谏鲜鼋Y果，本實驗采用625，125，25，50 mg·L-1的質量濃度梯度進行后續(xù)試驗。

32CSFE染色法檢測OMT對L02細胞增殖的影響根據(jù)CSFE熒光的倍減程度顯示，空白對照組在24 h內自然增殖3代，L02細胞被不同濃度OMT刺激24 h后，各個OMT濃度下的L02細胞也增殖3代，與空白組相比，未出現(xiàn)增殖小峰，無統(tǒng)計學差異，說明OMT不能促進L02細胞的增殖（圖2，表1）?；贑CK8檢測結果和原理，以及CSFE檢測結果，表明OMT可以促進L02細胞內NAD（P）H的增加。

33L02細胞氧化應激模型的建立本研究首先考察H2O2濃度和刺激時間對L02細胞損傷的影響，結果顯示隨著H2O2濃度的增加，L02細胞的存活率逐漸降低，且趨勢逐漸趨于平緩；隨著造模時間的延長，相同H2O2濃度下的L02細胞的存活率逐漸降低（圖3）。綜合考慮造模時間和造模濃度，以半數(shù)致死量為原則，本研究選擇造模時間為05 h和造模濃度為03 mmol·L-1的H2O2進行后續(xù)試驗。

34ANNEXIN ⅤFITC/7AAD法檢測凋亡細胞H2O2造模后L02細胞的凋亡率為256%±36%，較空白組明顯增加（P<005）；分別給625，125，25，50 mg·L-1的OMT干預后，凋亡率明顯下降，分別為112%±25%，998%±39%，138%±31%，153%±24%（P<005）；凋亡率與給藥

濃度呈現(xiàn)一定的劑量依賴關系，并且OMT在125 mg·L-1時抑制凋亡作用最強（圖4）。

35L02細胞內SOD，GSHPX活力、ROS含量測定OMT抑制雙氧水對L02細胞的損傷中SOD，GSHPX活力變化，與空白組相比，模型組中SOD活性顯著降低（P<005），GSHPX活性顯著降低（P<001）；與模型組比較，給藥組中SOD活性均顯著升高（P<005，P<001）、GSHPX活性均顯著升高（P<001），且OMT在125 mg·L-1時二者活性升高最多；與正常對照組相比，模型組中ROS

含量顯著升高（P<001）；與模型組相比，給藥組

4討論

苦參素（即氧化苦參堿）是從豆科槐屬植物苦參、廣豆根、管萼山豆根等植物中提取的生物堿，臨床上主要用于治療慢性乙型病毒性肝炎，臨床效果確切，是中華醫(yī)學會重點推廣治療乙型肝炎的藥物之一，同時對多種肝損傷也有較好的保護效果[16]。肝病的發(fā)生必然會引起肝實質細胞的損傷，活性氧引發(fā)的氧化應激又是多種肝病發(fā)生的病理基礎[1]，近年來氧化苦參堿的保肝作用機制研究主要集中在免疫調節(jié)方面，其在整體動物水平的抗氧化保肝作用報道較少。并且相比動物實驗的整體性和作用機制的復雜性，細胞實驗影響因素比較單一，具有動物整體實驗所不具備的優(yōu)勢與特色，能更為直接的說明其抗氧化作用。因此本實驗采用H2O2致L02細胞 （肝實質細胞）氧化應激損傷模型，單純從抗氧化作用方面來探討氧化苦參堿（OMT）的保肝作用。

CCK8檢測法是一種檢測細胞增值活性的常用方法，結果顯示，L02細胞在接受OMT刺激后，增殖活性增強；而采用CSFE細胞分裂跟蹤法檢測，結果顯示L02細胞未出現(xiàn)增值現(xiàn)象。基于上述2種矛盾的結果分析：CSFE細胞分裂跟蹤法是一種更直接檢測細胞增殖的方法，其結果更準確，OMT不能促進L02細胞的增殖；CCK8檢測法是一種間接檢測細胞增殖的方法，其檢測原理是通過檢測96孔細胞板中NAD（P）H增加的多少來間接說明細胞的增殖。所以CCK8結果表明，L02細胞接受OMT刺激后，實驗孔中NAD（P）H總含量增加。綜合2種方法的結果，本課題組判斷，OMT可以促進單個L02細胞內NAD（P）H含量增加。而NADPH是細胞內抗氧化防御系統(tǒng)的重要組成成分，對于維持GSH的還原狀態(tài)，保證細胞清除導致細胞氧化損傷的毒性物質ROS具有重要意義 [18]。因此可以推測OMT可能有抗氧化保肝作用。

為此，本課題組采用雙氧水建立氧化應激損傷模型來證明上述推測。但是由于H2O2的不穩(wěn)定性、細胞種類以及人為等因素的存在，不同文章中的H2O2的造模濃度及造模時間存在很大差異[1114]，本實驗綜合考慮造模時間和造模濃度因素，以半數(shù)致死量為原則，最終選擇造模時間為05 h和造模濃度為03 mmol·L-1的H2O2進行實驗。

基于上述造模條件，再給予一定濃度的OMT刺激，流式細胞術檢測發(fā)現(xiàn)氧化苦參堿明顯降低了L02細胞的凋亡率，且在125 mg·L-1時，凋亡率最小，說明OMT在一定濃度范圍內可以抑制H2O2誘導的L02細胞氧化應激導致的凋亡。

DCFHDA熒光探針法檢測發(fā)現(xiàn)雙氧水損傷L02細胞后，模型組產生了大量的活性氧ROS，并且細胞凋亡比例明顯增加。SOD，GSHPX均屬于內源性的抗氧化酶，可以直接清除活性氧ROS，本實驗發(fā)現(xiàn)L02細胞被雙氧水損傷后，胞內的SOD，GSHPX活性明顯降低，給藥后，二者活性顯著增強，同時胞內ROS含量明顯降低，細胞凋亡比例明顯下降，提示OMT可以通過增強SOD，GSHPX活性，從而清除活性氧ROS來降低凋亡的發(fā)生。

綜上所述，氧化苦參堿OMT可以增強L02細胞內的SOD，GSHPX活性以及NADPH的含量來清除H2O2誘導產生的活性氧 ROS，從而減輕氧化損傷所造成的細胞凋亡。氧化苦參堿或可以作為一種抗氧化保肝藥物的前體藥物來進一步研發(fā)。

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[責任編輯馬超一]