苦參堿類生物堿聯合胸腺肽抗HBV作用研究

劉曉瓊　沈宏輝　陳佳欣　柏兆方　王伽伯　肖小河

[摘要]該文主要研究4種苦參堿類生物堿分別聯合胸腺肽在HepG2215細胞上的抗病毒效果。分別將氧化苦參堿、苦參堿、槐果堿、槐定堿（濃度均為02 mmol·L-1）聯合胸腺肽（0025，01 g·L-1）于HepG2215細胞作用48，72 h后收集細胞及上清。采用CCK8法測定各實驗組細胞的（活性）來評價藥物對HepG2215細胞的毒性作用；采用酶聯免疫吸附試驗（ELISA）測定實驗組上清液中HBsAg，HBeAg的含量；采用熒光定量PCR法分別檢測細胞上清和胞內HBV DNA水平；采用CBA方法檢測上清液中細胞因子IFNα的表達量。結果顯示，單獨胸腺肽0025～04 g· L-1對細胞沒有毒性，在此濃度范圍內聯合02 mmol·L-1苦參堿類生物堿對細胞沒有毒性；苦參堿類生物堿聯合胸腺肽抗HBV效果優于單獨用堿或胸腺肽；單獨0025 g· L-1胸腺肽組對胞內HBV DNA的抑制效果優于單獨01 g· L-1胸腺肽組，而對于上清HBeAg的抑制效果則相反；01 g· L-1胸腺肽聯合堿和0025 g· L-1胸腺肽聯合堿抗HBV效果相當，4個生物堿和胸腺肽聯合抗HBV效果無統計學差異；總體來看，72 h抗HBV效果優于48 h（P<005）；聯合用藥之后IFNα的分泌量升高，和其他4個指標的變化成正相關（P<005）。結果表明，氧化苦參堿、苦參堿、槐果堿、槐定堿聯合胸腺肽可通過促進IFNα的表達來抑制HepG2215細胞HBsAg，HBeAg的分泌和HBV DNA的復制，進而促進抗病毒作用。

[關鍵詞]胸腺肽；苦參堿類生物堿；HepG2215細胞株；乙肝病毒

[Abstract]To investigate the antiviral effect of thymopolypeptides combined with 4 kinds of matrine type alkaloids on HepG2215 cells， oxymatrine， sophocarpidine， sophocarpine， and sophoridine （at concentration of 02 mmol·L-1 respectively） were respectively combined with thymopolypeptides （0025， 01 g·L-1）， and after 48 h and 72 h treatment on HepG2215 cells， the cells and supernatants were collected The cells activity in various groups was determined by CCK8 method to evaluate the toxic effects of the drugs on HepG2215 cells Enzyme linked immunosorbent assay （ELISA） was used to determine HBeAg and HBsAg levels in cellular supernatants HBV DNA levels in cellular supernatants andcells were quantified with fluorogenic quantitative PCR method； and the expression level of IFNα in supernatants was detected with CBA method The results indicated that single thymopolypeptides at 002504 g·L-1 had no toxicity to cells Thymopolypeptides in this concentration range combined with 02 mmol·L-1 matrine type alkaloids also had no toxicity to cells AntiHBV activity of drug combination was better than that of alkali or thymopolypeptides alone Thymopolypeptides at 0025 g·L-1 had better inhibitory effect than thymopolypeptides at 01 g·L-1 on intracellular HBV DNA expression， but the inhibitory effect on supernatant HBeAg level was on the contrary AntiHBV activity was similar between alkaloids combined with 01 g·L-1and alkaloids combined with 0025 g·L-1 There was no statistical difference in antiHBV effect between various combined groups （P<005） In general， 72 h antiHBV effect was better than 48 h antiHBV effect （P<005） The expression of IFNα was increased after drug combination， with positive correlation to the changes of other four indicators （P<005） In conclusion， oxymatrine， sophocarpidine， sophocarpine and sophoridine combined with thymopolypeptides could inhibit HBsAg and HBeAg secretion in HepG2215 cells and HBV DNA replication， and further promote the antiviral effect by promoting the expression of IFNα

[Key words]thymopolypeptides； matrine type alkaloids； HepG2215 cells； hepatitis B virus

doi：10.4268/cjcmm20160719

乙型病毒性肝炎是由乙型肝炎病毒（HBV）感染引起的傳染性疾病，其發病機制與機體免疫功能低下和免疫調節紊亂有關[1]。目前乙肝的治療主要是以核苷（酸）類似物、干擾素等抗病毒藥物為主，但是長期用藥容易導致病毒產生耐藥機制，使HBV難以被徹底清除。胸腺肽作為一種免疫調節劑，對腫瘤和慢性乙肝有一定的療效[2]；體外實驗研究已證實胸腺肽α1（Tα1）能顯著降低細胞培養上清液中HBsAg和HBeAg的濃度[3]，具有一定的體外抗病毒活性。但是胸腺肽效果不強，單獨使用胸腺肽難以達到完全清除HBV的目的?？鄥A類生物堿是從山豆根、苦參、苦豆子類中草藥中提取分離出來的單體化合物，主要包括氧化苦參堿、苦參堿、槐果堿、槐定堿，結構式見圖1?，F代藥理學研究發現，以氧化苦參堿為代表的苦參堿類生物堿具有保肝降酶、免疫調節以及抗乙肝病毒的作用，其免疫調節和抗病毒作用備受關注[45]。胸腺肽和苦參堿類生物堿的抗HBV機制不同于核苷類藥物，前者調控患者的免疫，后者具有多種生物學效應，因此可以考慮從胸腺肽聯合苦參堿類生物堿入手開展抗HBV尤其是耐藥株的治療，從而加強胸腺肽治療慢性乙肝的療效。由于目前尚未見到有關胸腺肽聯合苦參堿類生物堿抗HBV的報道，本實驗在細胞水平上對其聯合應用后的抗HBV效果進行研究。

1材料

HepG2215細胞株由北京市解放軍第302醫院實驗技術保障中心贈與。

氧化苦參堿，苦參堿，槐果堿，槐定堿（陜西昂盛生物醫藥科技有限公司，純度>98%）；DMEM培養液，胎牛血清FBS，G418（美國GIBCO公司）；胰蛋白酶和二甲基亞砜（美國Sigma公司）；Cell Counting Kit8檢測試劑盒（日本同仁化學研究所，批號JE914）；注射用胸腺肽（湖南科倫制藥有限公司，批號13111272B）；HBsAg 和HBeAg檢測試劑盒（北京科衛臨床診斷試劑有限公司，批號分別為201410003，201501001）；乙型肝炎病毒核酸定量檢測試劑盒（北京鑫諾美迪基因檢測技術有限公司）；96 孔板，24孔板，細胞培養瓶（康寧公司）；Human IFNα Flex Set （美國BD公司，批號560379）。

酶標儀（BioTek Synergy H1 H1MFD，美國）；二氧化碳培養箱（NAPCO Model 5410，美國）；臺式低速離心機（TD5A，湖南赫西儀器裝備有限公司）；常規倒置顯微鏡（上海澤權儀器設備有限公司）；臺式低速離心機（湖南赫西儀器裝備有限公司）；超凈工作臺（蘇州凈化設備有限公司）； FACS Calibur Flow Cytometry Syatem（BD 公司） 。

2方法

21細胞培養

HepG2215細胞常規培養于含10%肽牛血清的DMEM培養基（含青霉素100 U·mL-1，鏈霉素100 U·mL-1，G418 400 mg·L-1）中，置于37 ℃，5% CO2飽和濕度培養箱。

22CCK8法檢測藥物對細胞的毒性

取對數生長期的HepG2215細胞，以2×105個/mL接種100 μL于96孔板，24 h后加入不同濃度藥物，氧化苦參堿、苦參堿、槐果堿、槐定堿選擇02 mmol·L-1，胸腺肽選擇0025，005，01，02，04 g· L-1，設置單獨生物堿組、單獨胸腺肽組以及兩者聯合組，每個藥物濃度設3個復孔，置于37 ℃，5% CO2飽和濕度培養箱培養72 h后，吸出上清，每孔加入含10% CCK8的培養基100 μL，37 ℃孵育1 h，用酶標儀測定450 nm的吸光度（A）。設置空白對照和細胞對照，實驗至少重復3次。用以下公式計算不同濃度藥物作用的細胞存活率：細胞存活率=（A實驗孔-A空白孔） /（A對照孔-A空白孔）×100%。

23藥物體外抗HBV效果

231HBV DNA的檢測取對數生長期HepG2215細胞長滿培養瓶后轉種于24孔培養板上。細胞濃度稀釋為2×105個/mL，每孔1 mL細胞，24 h后加入不同濃度的藥物，氧化苦參堿、苦參堿、槐果堿、槐定堿選擇02 mmol·L-1，胸腺肽選擇0025，01 g· L-1，濃度設置均根據預實驗結果及參考文獻，設置單獨生物堿組、單獨胸腺肽組以及兩者聯合組，每個藥物濃度設3個復孔，設置不加藥的對照孔，每天觀察細胞生長情況。48，72 h收集上清培養液和細胞，收集的細胞上清用于HBsAg，HBeAg和HBV DNA的檢測，用PBS洗3遍細胞，加入500 μL PBS，將培養板凍于-80 ℃冰箱，反復凍融3次，高速離心，取上清，檢測HBV DNA。

232HBsAg和HBeAg的檢測按231項操作收集的細胞上清液，用HBsAg及HBeAg診斷試劑盒檢測HBsAg及HBeAg的表達，均用ELISA法檢測。按照試劑盒的說明操作，于酶標儀450 nm波長處測定各孔吸光度（A），計算其抑制率，抑制率=（A對照孔-A實驗孔）/A對照孔×100%。

233上清HBV DNA和胞內HBV DNA的檢測按231項操作收集的細胞上清液，采用實時熒光定量PCR法檢測HBV DNA，操作按試劑盒說明進行。用實驗孔與對照孔的滴度計算其抑制率，抑制率=（對照孔滴度-實驗孔滴度） /對照孔滴度×100%。

234CBA法檢測IFNα的表達水平將待檢樣品從-20 ℃冰箱中取出，置于37 ℃復蘇30 min，1 500 r·min-1離心5 min，吸取上層超懸物 50 μL 置于待檢管，同時加入50 μL捕獲微球，50 μL PE檢測試劑，室溫、避光孵育3 h。加入1 mL洗液，1 500 r·min-1離心5 min，棄上清，加入300 μL洗液上機。使用 BD Cell Quest 檢測，將標準品和待檢品捕獲數據轉入 BD CBA 軟件，劃出標準曲線和分析得出待檢品的結果。

24相互作用分析

用金正均Q值法判斷藥物相互作用程度。Q=Ea+b/（Ea+Eb-Ea×Eb），Ea+b為合并用藥的抑制率，Ea，Eb分別為A藥和B藥單獨用藥時的抑制率，式中分子代表實測合并效應，分母代表期望合并效應，Q即二者的比值。Q<085為拮抗（-），085≤Q<115為相加（+），Q≥115為協同（）。

25統計學分析

采用SPSS 200軟件，應用配比t檢驗、相關分析和Oneway ANOVA進行統計分析。如果P<005，數據有統計學差異；反之，則沒有統計學差異。

3結果

31藥物對HepG2215細胞的細胞毒性

采用CCK8法研究藥物對HepG2215細胞的毒性作用，結果見圖2，單獨胸腺肽0025～04 g·L-1和其聯合02 mmol·L-1苦參堿類生物堿對HepG2215細胞存活率都在90%以上，說明所選濃度對細胞正常生長無顯著性影響。

32胸腺肽和苦參堿類生物堿單獨給藥及聯合給藥的抗HBV效果比較

321苦參堿類生物堿和胸腺肽聯合應用的抗HBV效果優于單藥氧化苦參堿、苦參堿、槐果堿和槐定堿聯合胸腺肽的抗HBV效果見圖3，表1。當苦參堿類生物堿分別聯合0025 g·L-1胸腺肽時，給藥48 h后，氧化苦參堿聯合胸腺肽組對上清HBsAg和HBeAg抑制率均高于單用生物堿或胸腺肽，4個生物堿分別聯合胸腺肽對上清HBV DNA抑制率均高于單用生物堿或胸腺肽；72 h后4個生物堿聯合用藥的HBsAg，HBeAg，上清HBV DNA抑制率都顯著高于相應的單用生物堿或胸腺肽。當苦參堿類生物堿聯合01 g·L-1胸腺肽時，48 h后氧化苦參堿、苦參堿分別聯合胸腺肽組的上清HBV DNA抑制率均高于相應的單用生物堿或胸腺肽組，4個生物堿分別聯合胸腺肽的HBsAg，HBeAg，胞內HBV DNA抑制率都顯著高于相應的單用生物堿或胸腺肽；72 h后4個生物堿聯合用藥的HBsAg，HBeAg，上清HBV DNA，胞內HBV DNA抑制率都顯著高于相應的單用生物堿或胸腺肽。結果顯示苦參堿類生物堿氧化苦參堿、苦參堿、槐果堿和槐定堿聯合胸腺肽的抗HBV效果顯著優于單用生物堿或胸腺肽。

322苦參堿類生物堿聯合不同濃度胸腺肽的抗HBV效果給藥48 h后，單獨01 g·L-1胸腺肽對胞內HBV DNA的抑制率高于單獨0025 g·L-1胸腺肽；72 h時，單獨0025 g·L-1胸腺肽對HBsAg抑制率、胞內HBV DNA抑制率高于單獨01 g·L-1胸腺肽。

苦參堿類生物堿聯合01 g·L-1胸腺肽對HBeAg抑制率高于其聯合0025 g·L-1胸腺肽；但是苦參堿類生物堿聯合0025 g·L-1胸腺肽對上清HBV DNA抑制率高于其聯合01 g·L-1胸腺肽。

323不同苦參堿類生物堿聯合胸腺肽的抗HBV效果比較當苦參堿類生物堿聯合0025 g·L-1胸腺肽時，給藥48 h后，苦參堿對上清HBV DNA抑制率和HBeAg抑制率高于氧化苦參堿；給藥72 h時，氧化苦參堿對上清HBV DNA抑制率低于其他生物堿，苦參堿對HBeAg抑制率低于其他生物堿。

當苦參堿類生物堿聯合01 g·L-1胸腺肽時，給藥48 h后，槐定堿對HBsAg抑制率高于表抗；給藥72 h后，氧化苦參堿對胞內HBV DNA抑制率、HBsAg抑制率、HBeAg抑制率低于苦參堿。

3242個時間點的比較當苦參堿類生物堿聯合0025 g·L-1胸腺肽時，72 h的苦參堿和槐果堿對上清HBV DNA，HBsAg，HBeAg抑制率高于48 h；當苦參堿類生物堿聯合01 g·L-1胸腺肽時，72 h后4個生物堿對上清HBV DNA抑制率和胞內HBV DNA抑制率高于48 h后。

33細胞上清中IFNα的表達

各組IFNα的表達量見表2，48 h 02 mmol·L-1生物堿聯合0025 g·L-1胸腺肽組的IFNα分泌量高于單獨胸腺肽組，有統計學差異（P<005），02 mmol·L-1生物堿聯合0025 g·L-1胸腺肽組的IFNα分泌量高于聯合01 g·L-1胸腺肽組，差異有統計學意義（P<005）；72 h所有的聯合用藥組的IFNα分泌量高于單獨用藥組，差異有統計學意義（P<005）；各時間點不同生物堿聯合用藥組之間無顯著性差異。

IFNα與其他指標的相關性分析見表3，IFNα的表達變化和上清HBV DNA，胞內HBV DNA，上清HBsAg，上清HBeAg的變化呈正相關性。

4討論

HepG2215細胞株是1986年Sureau等[6]用克隆的HBVDNA轉染人肝癌細胞HepG2建立的細胞株，該細胞株攜帶有HBV基因組，能夠模擬體內肝細胞復制、組裝和分泌HBV的過程，持續穩定地高水平分泌 HBsAg，HBeAg和乙肝病毒Dane顆粒， 是一個研究HBV生命活動的良好細胞系。HepG2215細胞出現后，很快應用于HBV致病機制和抗HBV藥物評價研究，得到國內外廣泛認可，一直應用至今[79]。HBV感染機體后通過其基因組與人體肝細胞整合來持續產生HBV，HepG2215細胞與此類似，同時還具有HepG2的穩定生長特性所以易于體外培養。因此，雖然HepG2215的來源細胞HepG2是腫瘤細胞，但是并不影響其HBV相關研究。

胸腺肽是從健康動物組織中提取出來的天然多肽，具有增強和調節人體免疫功能的作用。用于治療各種原發性或繼發性T細胞缺陷病，某些自身免疫性疾病，各種細胞免疫功能低下的疾病及腫瘤的輔助治療[10]。由于胸腺肽能夠促進 T 細胞免疫功能的恢復[11]，而且胸腺肽增加乙肝患者抗病毒蛋白的合成，所以胸腺肽用于免疫治療在臨床上受到重視。據報道，很多中藥比如山豆根、艾葉、白術可以誘生干擾素[12]，而干擾素有直接抗病毒作用[13]。實驗中發現苦參堿類生物堿可以誘導IFNα的A，B分別為48，72 h上清HBV DNA抑制率；C，D分別為48，72 h胞內HBV DNA抑制率；E，F分別為48，72 h HBsAg抑制率；G，H分別為48，72 h HBeAg抑制率。聯合用藥1組. 02 mmol·L-1苦參堿類生物堿聯合0025 g·L-1胸腺肽；聯合用藥2組. 02 mmol·L-1苦參堿類生物堿聯合01 g·L-1。與單獨胸腺肽組比較1）P<005，與單獨生物堿組比較2）P<005。

表達，聯合胸腺肽之后，IFNα的表達量增加，IFNα的變化和其他指標呈正相關性，提示胸腺肽和苦參堿類生物堿單獨或者聯合用藥可能是通過促進IFNα的表達來增強抗病毒效果的。

胸腺肽目前常用于慢性乙型肝炎的臨床治療，但是使用劑量不統一。通過實驗表明，不同濃度的胸腺肽對HepG2215細胞的抗HBV效果不同。在抑制HBeAg方面，單獨0025 g· L-1胸腺肽的效果優于單獨01 g· L-1胸腺肽，但是對于胞內HBV DNA抑制率，單獨01 g· L-1胸腺肽效果優于單獨0025 g· L-1胸腺肽。胸腺肽不同濃度在細胞實驗上的不同效果可知胸腺肽不同劑量對機體反應功能的調節也不同。這提示，在今后的臨床合理應用中，針對不同疾病不同表征的用藥劑量及規律，需要根據病人體質和病情的發展來研究和探討。

臨床研究表明采用胸腺肽聯合干擾素或核苷（酸）類似物治療慢性乙肝具有確切療效[1416] ，體外實驗證實氧化苦參堿和拉米夫定聯合用藥能夠顯著提高HBV的抑制水平[17]，氧化苦參堿可能會抑制耐藥HBV的復制，從而和核苷類藥物形成互補關系來協同抗病毒。但對于那些對核苷類似物容易產生耐藥性以及對干擾素的治療無效的慢性乙型肝炎患者來說，該療法仍有一定的局限性。苦參堿類藥品聯合胸腺肽較少運用于實際臨床治療中，但是其對慢性乙型肝炎和腫瘤的預后治療還是有一定療效[1820]。本實驗中，2個濃度的胸腺肽聯合苦參堿類生物堿之后的抗HBV效果基本相當，且都優于單獨胸腺肽的效果。這提示在臨床用藥中，對于不宜接受干擾素或核苷（酸）類似物治療的病人，可以嘗試用苦參堿類藥品聯合胸腺肽進行抗病毒治療。

綜上所述，苦參堿類生物堿聯合胸腺肽抗HBV效果優于單獨用藥，其抗病毒機制可能與誘導IFNα的表達有關。二者的聯合使用具有較高的臨床研究價值和應用前景。此外，苦參堿類生物堿無論是單獨還是聯合用藥，其抗病毒機制還有待進一步研究。

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[責任編輯馬超一]