HPLC睧LSD同時測定不同產地醉魚草果實中3種三萜皂苷的含量

吳培云　任亞碩　吳德玲　喬金為

[摘要]建立了HPLCELSD測定醉魚草果實中三萜類成分含量的方法。采集不同產地醉魚草果實藥材共9批，采用反相高效液相色譜蒸發光散射檢測法測定其三萜成分。色譜條件：Waters SunFireTM C18柱（46 mm×150 mm，5 μm），流動相為甲醇水（82∶18）溶液，體積流量1 mL·min-1，柱溫30 ℃。ELSD參數：漂移管溫度106 ℃，噴霧溫度50 ℃，載氣（N2）流速15 L·min-1，增益系數1。結果表明醉魚草果實中的3種三萜成分clinoposaponin Ⅲ， desrhamnoverbascosaponin， mimengoside Ⅰ的進樣量分別在0702～2808 μg（r=0999 2），0390～1560 μg（r=0998 9），0192～768 μg（r=0999 0）呈良好線性關系；平均加樣回收率（n=6）分別為9941%，9908%，9867%，相對標準偏差分別為086%，16%，18%。該方法簡便、準確、可靠，適用于測定醉魚草果實中三萜類成分的含量。

[關鍵詞]醉魚草；三萜；HPLCELSD；含量測定

[Abstract]To establish an HPLCELSD method for the quantification of triterpenoids in the fruits of Buddleja lindleyana The RPHPLCELSD method was used for the determination of triterpenoids in B lindleyana fruits， which were collected from different habitats The column used was a packed with 5 μm stationary phase Waters SunFireTM C18（46 mm×150 mm， 5 μm） The mobile phase consisted of Methanolwater（82∶18） at a flow rate of 1 mL·min-1 Column temperature： 30 ℃ ELSD conditions： drift tube temperature： 106 ℃； carrier gas （nitrogen） flow rate： 15 L·min-1； amplification factor： 1 The calibration curves showed good linear relationship on a range from 0702 to 2808 μg（r=0999 2） for Clinoposaponin III， 0390 to 1560 μg（r=0998 9） for Desrhamnoverbascosaponin and 0192 to 768μg（r=0999 0） for Mimengoside I The average recovery rate（n=6） were 9941%， 9908% and 9867% and it′s RSD were 086%， 156% and 180% This method can be used to determine the contents of triterpenoids in the fruits of Buddleja lindleyana for its simplicity， accurateness and reliability

[Key words]Buddleja lindleyana； triterpenoids； HPLCELSD； determination of content

doi：10.4268/cjcmm20160710

醉魚草果實藥材為馬錢科Loganiaceae植物醉魚草Buddleja lindleyana Fortune的果實，具有祛風除濕、止咳化痰、散瘀之功效[1]。課題組通過對醉魚草果實的系統研究發現，醉魚草果實分離所得的單體化合物中，三萜及其苷類占絕大多數，且具有一定的神經細胞保護活性[24]。為了加強對醉魚草資源的綜合開發利用，本文對采集自萬佛山、天柱山、歙縣3個不同產地醉魚草果實中齊墩果烷型三萜皂苷的含量進行了測定。

三萜類成分的含量測定一般采用香草醛冰醋酸、高氯酸顯色法，本課題組前期已建立了紫外分光光度法測定醉魚草果實中總三萜含量的方法[5]，雖可為醉魚草果實中三萜含量的測定提供參考，但該方法準確度不高，專屬性較差，有一定的局限性，考慮到醉魚草果實中的三萜成分紫外吸收不強，本實驗選用通用型蒸發光散射檢測器（evaporative light scattering detector，ELSD）。本文首次報道了HPLCELSD[67]測定醉魚草果實中三萜成分的含量，并對不同產地的醉魚草果實藥材進行分析，以期為醉魚草的質量研究提供參考。

1材料

11儀器美國Agilent 1260高效液相色譜儀（二元泵 G1312C，柱溫箱 G1316A；自動進樣器 G1329B，檢測器 380ELSD）；分析天平（瑞士METTLER TOLEDO AB135S）；高速中藥粉碎機（浙江省溫嶺市百樂粉碎設備廠 FZ02型）；超聲清洗儀（天津奧特塞恩斯 AS3120）；一體式超純水系統（德國默克密理博MilliQ）。

12試藥clinoposaponin Ⅲ，desrhamnoverbascosaponin，mimengoside Ⅰ的對照品均從醉魚草果實提取物中分離得到，并由現代波譜技術鑒定了其化學結構，見圖1。用歸一化法測得3種對照品純度均大于98%；甲醇為色譜純，水為實驗室自制超純水，其余試劑均為分析純。醉魚草果實藥材分別采自安徽舒城萬佛山（2012年11月）、潛山天柱山（2013年9月）以及歙縣（2013年11月）地區，經安徽中醫藥大學藥學院劉守金教授鑒定為馬錢科植物醉魚草B lindleyana的果實。

2方法及結果

21對照品溶液的制備精密稱取在五氧化二磷減壓干燥器中干燥36 h的化合物clinoposaponin Ⅲ，desrhamnoverbascosaponin，mimengoside Ⅰ對照品2633，1462，721 mg，分別置于25 mL量瓶中，加甲醇溶解后定容至刻度，得質量濃度為1053，0585，0288 g·L-1的對照品溶液，然后將此3個對照品溶液按1∶1∶1混合，即得質量濃度分別為0351，0195，0096 g·L-1的混合對照品溶液。

22供試品溶液的制備精密稱取不同產地醉魚草果實粗粉2 g，置50 mL圓底燒瓶中，加80%乙醇20 mL回流提取3次，每次1 h，合并濾液，轉移置100 mL量瓶中，加甲醇稀釋并定容至刻度，即得供試品溶液。

23色譜條件與系統適用性試驗色譜條件：Waters SunFireTM C18柱（46 mm×150 mm，5 μm），流動相為甲醇水（82∶18）溶液，體積流量1 mL·min-1，柱溫30 ℃。ELSD參數：漂移管溫度106 ℃，噴霧溫度50 ℃，載氣（N2）流速15 L·min-1，增益系數1。在色譜條件下，取供試品溶液、對照品溶液分別進樣20 μL，3種成分均能與其他組分達到基線分離，對照品溶液及供試品溶液的HPLC色譜圖見圖2。

24線性關系考察對照品溶液采用自動進樣器進樣，進樣量依次為2， 5， 10， 20， 40， 60， 80 μL，按照23項下的色譜條件測定峰面積，以對照品進樣量（μg）的常用對數為橫坐標X，色譜峰面積值的常用對數為縱坐標Y，繪制標準曲線。得線性回歸方程見表1。

25精密度試驗對照品溶液采用自動進樣器精密吸取20 μL，連續進樣6次，測定峰面積。得出clinoposaponin Ⅲ，desrhamnoverbascosaponin，mimengosideⅠ對應峰面積的相對標準偏差（relative standard deviation， RSD）分別為088%，096%，16%，說明儀器精密度良好。

26重復性試驗按22項方法制備6份供試品溶液，分別進樣20 μL，測定clinoposaponin Ⅲ，desrhamnoverbascosaponin，mimengosideⅠ的色譜峰面積，計算平均質量分數分別為2152%，0806%，0194%，RSD（n=6）分別為12%，10%，20%。表示該方法測定這3種三萜含量的重復性良好。

27穩定性試驗取同一供試品溶液，分別在0，2，4，8，12 h自動進樣20 μL，測定clinoposaponin Ⅲ，desrhamnoverbascosaponin，mimengosideⅠ的對應色譜峰面積，計算RSD（n=5）分別為12%，084%，14%，說明供試品溶液在12 h內基本穩定。

28加樣回收率試驗精密稱取萬佛山產地的醉魚草果實粗粉9份（3種三萜質量分數分別為2152%，0806%，0194%），每份10 g，分別向其中加入低、中、高3種質量濃度的對照品溶液（分別相當于藥材原有含量的50%，100%，150%），每一質量濃度取3份，按22項方法制備供試品溶液，得6份加標溶液。采用自動進樣器分別精密進樣20 μL，計算加樣回收率。結果得clinoposaponin Ⅲ的加樣回收率為9941%，RSD 086%；desrhamnoverbascosaponin的加樣回收率為9908%，RSD為16%；mimengosideⅠ的加樣回收率為9867%，RSD 18%，結果見表2，實驗證明，加樣回收率良好。

29樣品含量測定取不同產地的醉魚草果實（萬佛山、天柱山、歙縣），按22方法進行操作，分別制成供試品溶液，同一批次平行測定2份。在23色譜條件下各進樣20 μL，測定不同產地醉魚草果實中clinoposaponin Ⅲ，desrhamnoverbascosaponin，mimengosideⅠ的平均含量（n=3），結果見表3。

從試驗得出的數據進行分析得出，不同產地的醉魚草果實中三萜成分的含量存在差異，以天柱山產地的clinoposaponin Ⅲ含量較高，而萬佛山產地的desrhamnoverbascosaponin，mimengosideⅠ含量較高。本實驗建立的HPLCELSD法測定3種三萜皂苷的含量，可以在一定程度上反映出醉魚草果實中三萜類成分的總含量。

3討論

本實驗在課題組前期研究基礎上，參考正交試驗設計優選出的最佳提取工藝[8]，最終選定80%乙醇，回流提取3次，每次1 h，料液比1∶10提取。

MimengosideⅠ附近的峰分離有一定難度，本實驗考察了甲醇水系統80∶20，85∶15，82∶18，84∶16等多種流動相的比例，最終選定甲醇水82∶18時分離度最好，峰形也較好，并能使檢測組分在20 min內實現較好的分離。根據流動相比例，分別在100，106，110 ℃的漂移管溫度下，考察載氣流速，最終確定ELSD檢測器最優參數：漂移管溫度106 ℃，N2流速15 L·min-1。

本文選取從醉魚草果實中分得的3種齊墩果烷型三萜皂苷類化合物clinoposaponin Ⅲ，desrhamnoverbascosaponin，mimengosideⅠ作為指標性成分，其中mimengosideⅠ為課題組首次報道的新化合物[3]，采用HPLCELSD測定其中三萜類成分，相比于課題組前期建立的紫外分光光度法[5]，準確度更高、專屬性更強。HPLCELSD測得結果，在一定程度上能反應醉魚草果實中三萜類成分的總含量，方法學試驗證明實驗結果穩定可靠，表明該方法可行性較高。不同產地的醉魚草果實中三萜成分的含量存在差異，這可能與產區生態環境、藥材采收時間等因素有關，后續可開展有關醉魚草不同采收期化學成分研究的實驗工作。

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[責任編輯呂冬梅]