Xpert MTB/RIF系統檢測兒童肺結核灌洗液標本結果分析

牛　波，劉建華，曹麗潔，帥金鳳，池躍朋

(1.河北省兒童醫院　呼吸二科，河北　石家莊　050000；2.河北省胸科醫院　二病區，河北　石家莊　050000)

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·臨床醫學·

Xpert MTB/RIF系統檢測兒童肺結核灌洗液標本結果分析

牛波1，劉建華1，曹麗潔1，帥金鳳1，池躍朋2

(1.河北省兒童醫院呼吸二科，河北石家莊050000；2.河北省胸科醫院二病區，河北石家莊050000)

【摘要】目的：應用Xpert MTB/RIF系統對兒童肺結核灌洗液標本進行結核分枝桿菌與利福平耐藥基因檢測并探討其應用價值。方法：收集河北省兒童醫院和河北省胸科醫院臨床確診為肺結核患兒的126份灌洗液標本，分別行羅氏培養基結核分枝桿菌培養、藥物敏感性試驗和Xpert MTB/RIF系統檢測。結果：Xprt MTB/RIF系統檢測需要2 h左右，其結核分枝桿菌檢出率為59.52% (75/126)；在28份培養陽性標本中，Xpert MTB/RIF檢測結核分枝桿菌的敏感度為96.43% (27/28)；在98份培養陰性標本中，Xpert MTB/RIF檢測結核分枝桿菌的敏感度為48.98% (48/98)；Xpert MTB/RIF系統利福平耐藥性檢測的敏感度為100.00% (2/2)。結論：Xpert MTB/RIF系統是一種快速、簡便、陽性率高且能夠同時檢測利福平耐藥性情況的檢測技術，具有較高的臨床應用價值。

【關鍵詞】結核分枝桿菌；利福平；Xpert MTB/RIF系統

【DOI】10.3969/j.issn.1002-0217.2016.02.010

近些年由于艾滋病等免疫低下疾病增多、結核分枝桿菌耐藥性增強以及防控體系的不完善等現狀，全球結核病疫情已不容樂觀。兒童是結核病的易感人群，2013年全球有900萬人罹患結核病，約55萬例為兒童[1]。肺結核患兒痰標本不易留取，通過纖維支氣管鏡技術留取灌洗液可提高診斷率，但仍不理想，延誤治療的情況十分常見。隨著診斷技術的發展，Xpert MTB/RIF系統的出現受到國內外廣泛關注。Boehme等[2]研究表明該技術靈敏度和特異度高、省時、操作簡便、應用前景好。本研究對Xpert MTB/RIF系統在兒童肺結核結核分枝桿菌及利福平耐藥性診斷中的檢測效率及臨床價值進行探討。

1對象和方法

1.1研究對象選擇河北省兒童醫院和河北省胸科醫院2013年6月～2015年3月收治的臨床診斷為肺結核的初診患兒126例，均無抗結核治療史，入組患兒的診斷均符合兒童肺結核臨床診斷標準[3]，行纖維支氣管鏡檢查前，痰涂片抗酸染色三次檢查陰性或無痰。所有患兒均符合兒科支氣管鏡術指南[4]中的檢查適應證，家屬均簽署了知情同意書。

1.2試劑抗酸染色液、羅氏固體培養基及藥敏試劑(珠海貝索生物技術有限公司生產)；Xpert MTB/RIF檢測儀及試劑盒(美國Cepheid公司)。

1.3方法

1.3.1標本留取Olympus P260F纖維支氣管鏡檢查前，7歲以下兒童采用異丙酚靜脈復合麻醉，7歲以上兒童采用利多卡因氣管內黏膜表面麻醉。患兒取仰臥位，纖維支氣管鏡經鼻腔進入，檢查各部分病變情況后，在病灶部位經導管注入適量生理鹽水，收集灌洗液。取出部分灌洗液分為2份，1份用于羅氏培養，1份用于Xpert MTB/RIF檢測，剩余灌洗液凍存備用。

1.3.2結核分枝桿菌羅氏培養及比例法藥敏試驗按照結核病診斷實驗室檢驗規程[5]進行。

1.3.3Xpert MTB/RIF檢測灌洗液標本中加入消化液，使其與灌洗液比例為1∶1(v/v)，擰緊蓋子，劇烈搖動數次。室溫放置15 min，待混合液中無可見成分時，吸取2 mL混合液加入Xpert MTB/RIF反應試劑盒中，然后將反應盒放入4通道Gene Xpert平臺中自動運行2 h左右，系統可顯示出結核分枝桿菌檢測結果及利福平耐藥情況。詳細過程按說明書進行。試驗采用盲法，即Xpert MTB/RIF檢測和培養藥敏試驗分別由不同的工作人員來完成。

1.4統計學方法分別計算兩種方法的陽性率，采用SPSS 19.0軟件對數據進行分析，兩種方法間的比較采用配對χ2檢驗，P<0.05表示差異有統計學意義。

2結果

2.1羅氏培養與Xpert MTB/RIF系統結核分枝桿菌檢測126例灌洗液標本中羅氏培養陽性28例(22.22%)，Xpert MTB/RIF系統結核分枝桿菌檢出75例(59.52%)；28份培養陽性標本中，XpertMTB/RIF系統結核分枝桿菌檢出27例(96.43%)；98份培養陰性標本中，Xpert MTB/RIF系統結核分枝桿菌檢出48例(48.98%,表1)。Xpert MTB/RIF系統結核分枝桿菌檢測陽性率高于羅氏培養法，差異有統計學意義(配對χ2=45.08，P<0.001，表2)。本研究因沒有非結核分枝桿菌作為對照組，因此不對Xpert MTB/RIF系統的特異性進行評價。

表1羅氏培養法與Xpert MTB/RIF系統結核分枝桿菌檢測結果比較

方法陽性陰性羅氏培養2898XpertMTB/RIF系統7551

表2兩種方法檢測結果統計學比較

羅氏培養法XpertMTB/RIF系統檢測+-合計+27128-485098合計7551126

配對χ2=45.08，P<0.001。

2.2Xpert MTB/RIF系統檢測次數對結果的影響羅氏培養陽性而Xpert MTB/RIF系統首次檢測為陰性的有2例標本，對其再次進行檢測，其中1例為陽性，靈敏度由92.86%上升到96.43%。

2.3兩種方法利福平耐藥檢測情況28例培養陽性標本，其中比例法藥敏試驗顯示利福平耐藥菌株2株，耐藥率為7.14%(2/28)；比例法耐藥的患者標本中，Xpert MTB/RIF系統檢出耐藥株2例，靈敏度為100.00%(2/2)；比例法敏感菌中，Xpert MTB/RIF系統檢測為耐藥1例，特異度為96.15%(25/26)。

3討論

隨著抗結核藥物的發現，結核病的預后有了極大改善，然而，耐藥結核分枝桿菌日益增多，新藥物研發滯后的情況，給結核病的防治工作帶來了極大挑戰。耐藥肺結核治愈后容易復發，化療周期長，使兒童肺結核的診治較成人更為復雜，及時診斷并按藥敏試驗結果進行化療對有效治療兒童肺結核至關重要。當今，羅氏培養法及藥敏試驗結果可靠，是診斷耐藥結核病的“金標準”。但是培養需要4～8周，藥敏試驗需要4周左右，很多患者由于不能及時診治而延誤治療，造成患者預后不佳甚至死亡。

Xpert MTB/RIF檢測系統是一種采用巢式PCR技術，以利福平耐藥相關rpoB基因為靶基因，可在2 h左右同時檢測結核分枝桿菌和利福平耐藥性的自動化、全封閉檢測平臺[6]。巢式PCR的應用使其敏感性提高了2～3個數量級，同時減少了非特異性擴增。由于大多數利福平耐藥的結核分枝桿菌同時存在異煙肼耐藥，在一定程度上利福平耐藥情況可作為耐多藥結核病的監測指標[7]。近年來，Xpert MTB/RIF系統應用于各種臨床標本，成為WHO推薦使用的診斷技術[8-9]。

本研究采用Xpert MTB/RIF檢測系統可以發現96%以上的經灌洗液培養證實的肺結核病患兒。經臨床癥狀、影像學高度懷疑為肺結核的患兒，但培養陰性的標本中，陽性率可達48.98%以上，明顯提高了小兒肺結核的診斷效率和鑒別診斷的能力。在Xpert MTB/RIF檢測利福平耐藥性方面，其敏感度與特異度分別為100.00%與96.15%。敏感度達到100.00%可能和樣本數較少有關，此系統利福平耐藥相關rpoB基因的檢測是根據rpoB耐藥決定區的81 bp范圍內序列設計了5對探針并標記不同的熒光基團，以實現對MTB野生株在5個探針對應位置的擴增，突變株不能被擴增出，該系統沒有覆蓋所有的突變位點。Nicol等[10]用Xpert MTB/RIF技術對南非年齡<15歲結核病兒童的檢測結果顯示靈敏度為74.0%，遠低于FIND基金會對成人調查的98.2%[11]，此研究對126例患兒灌洗液檢測的敏感度為59.52%，其結果較成人低的原因可能與患兒標本量少、標本合格率低、含菌量較少有關。有兩個標本第一次沒有得出結果，可能是標本未處理好、質量控制出現了問題或試劑盒不合格，從而影響了DNA擴增。另外，Xpert MTB/RIF系統檢出時間在2 h左右，檢測過程在密閉系統中自動完成，不僅快速，而且還降低了生物安全的風險。

綜上所述，Xpert MTB/RIF檢測系統快速、簡便、陽性率高，在兒童結核病的早期診斷和利福平耐藥評估方面優于傳統的羅氏培養和比例法藥敏實驗，對早期診療具有積極影響，在醫療系統和疾控部門具有良好的應用前景。

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Assessment of Xpert MTB/RIF assay for the detection ofMycobacteriumtuberculosis andrifampicin resistance in bronchoalvelor lavage fluid of children with pulmonary tuberculosis

NIUBo,LIUJianhua,CAOLijie,SHUAIJinfeng,CHIYuepeng

Department of Respiratory Diseases,Hebei Provincial Children′s Hospital,Shijiazhuang 050000,China

【Abstract】Objective：To assess the performance of the Xpert MTB/RIF system in the detection of Mycobacterium tuberculosis and rifampicin resistance in the bronchoalvelor lavage fluid(BALF) from children with pulmonary tuberculosis.Methods:126 BALF specimens,obtained from the children clinically diagnosed as pulmonary tuberculosis respectively in the Children′s Hospital of Hebei and Hebei Chest Hospital,were subjected to culturing in Lowenstein-Jensen medium,test of drug sensitivity and Xpert MTB/RIF assay.Results:The mean run time of Xpert MTB/RIF system was about 2 hours,and its sensitivity was 59.52% (75/126).In 28 positive cultures and 98 negative cultures,the sensitivity of the Xpert MTB/RIF assay was 96.43% (27/28) and 48.98% (48/98),respectively.In addition,Xpert MTB/RIF had a sensitivity of 100.00% (2/2) in determination of rifampicin resistance.Conclusion:The Xpert MTB/RIF is of great clinical value,for it is a rapid,convenient and accurate tool to detect the Mycobacterium tuberculosis as well as rifampicin resistance based on BALF specimens from chidren with pulmonary tuberculosis.

【Key words】Mycobacterium tuberculosis;rifampin;Xpert MTB/RIF system

【文獻標識碼】【中圖號】R 725.1A

作者簡介：牛波(1978-)，女，主治醫師，(電話) 13833132393，(電子信箱) 24201475@qq.com;

收稿日期：2015-06-16

基金項目：河北省衛生廳重大專項(20130397)

文章編號：1002-0217(2016)02-0140-03

池躍朋，男，主治醫師，(電子信箱) chiyuepeng2013@163.com，通訊作者.