遠端肢體缺血預處理對失血性休克液體復蘇大鼠心肌損傷的保護作用研究

林輝　劉雋華　周天恩　楊正飛

510640 廣州，華南農業大學醫院內科(林輝)；510700 廣州，中山大學附屬第一醫院黃埔院區皮膚科(劉雋華)；510120 廣州，中山大學孫逸仙紀念醫院急診科(周天恩，楊正飛)

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遠端肢體缺血預處理對失血性休克液體復蘇大鼠心肌損傷的保護作用研究

林輝劉雋華周天恩楊正飛

510640 廣州，華南農業大學醫院內科(林輝)；510700 廣州，中山大學附屬第一醫院黃埔院區皮膚科(劉雋華)；510120 廣州，中山大學孫逸仙紀念醫院急診科(周天恩，楊正飛)

【摘要】目的利用心臟超聲、心電圖以及心肌損傷標志物綜合評價遠端肢體缺血預處理對失血性休克液體復蘇大鼠心肌損傷的保護作用。方法成年健康雄性SD大鼠(300～350 g)36只，隨機分為3組(n=12)：空白對照組(C組)、失血性休克復蘇組 (SR組)和遠端肢體缺血預處理組 (RIPC組)。經股動脈持續1 h放出全身血容量的50%血液，1 h后由股靜脈30 min回輸全部自體血，建立失血性休克和復蘇模型。RIPC組于放血前40 min采用止血帶阻斷雙側后肢血流5 min，松開5 min，反復4次，行遠端肢體缺血預處理。于基礎狀態(BL)、放血結束即刻(S1)、回輸自體血液前(S2)、回輸結束即刻(R1)、回輸后1 h(PR1h)以及2 h(PR2h)，記錄心電圖以及平均動脈壓(MAP)，采用心臟彩色多普勒超聲測量心輸出量、LVEF、左心室短軸縮短率(FS)以及左心室心肌活動指數(Tei Index)，利用免疫化學發光儀檢測動脈血在BL、S2、PR2h時間點的心肌肌鈣蛋白I(cTnⅠ)濃度，觀察大鼠復蘇后72 h存活情況。結果與C組相比，SR組在S1至PR2h時，RIPC組在S1和S2時MAP、心輸出量、LVEF降低，Tei Index升高(P<0.01)；和SR組比較，RIPC組在復蘇開始后的MAP、心輸出量、LVEF升高，Tei Index降低(P<0.01)；在S1至PR2h，SR組與RIPC組ST段偏移程度以及cTn I濃度比C組增加(P<0.01)；然而，RIPC組的ST段偏移程度較SR組輕(P<0.01)，復蘇存活率較高(P<0.01)。結論遠端肢體缺血預處理顯著減輕失血性休克液體復蘇后大鼠的心肌缺血再灌注損傷，明顯改善了生存預后。

【關鍵詞】休克; 心肌缺血再灌注損傷; 缺血預處理; 心功能; 肌鈣蛋白I

心胸外科手術、選擇性血管外科手術、腫瘤切除術中均可能并發大出血，導致失血性休克[1]。盡管及時的液體復蘇后可以糾正血流動力學，然而缺血再灌注引起的心肌損傷不利于預后[2-3]。許多研究證實，遠端肢體缺血預處理可改善缺血再灌注導致的心肌損傷[4]。然而遠端肢體缺血預處理減輕失血性休克液體復蘇后誘發的心肌損傷程度的研究并不多見。心臟超聲、心電圖以及心肌損傷標志物的變化綜合反映心肌損傷的嚴重程度[5-6]。本研究擬從心臟超聲以及心電圖等方面評價遠端肢體缺血預處理對失血性休克液體復蘇大鼠心肌損傷的保護作用。

材料與方法

一、 動物選擇及隨機分組

成年健康雄性10周齡的SD大鼠36只，體質量300～350 g，由廣州中醫藥大學動物實驗中心提供，普通安靜的環境[溫度(25±1)℃，濕度(50±5)%]適應性飼養1周后開始實驗。應用隨機數字表方法，把動物分為3組：空白對照組(C組，n=12)、失血性休克復蘇組(SR組，n=12)和遠端肢體缺血預處理組(RIPC組，n=12)。

二、 失血性休克復蘇動物模型的制備

大鼠麻醉前禁食12 h，自由飲水。利用二氧化碳誘導麻醉后，腹腔注射戊巴比妥鈉50 mg/kg麻醉，仰臥位固定在實驗臺上。取頸正中切口，置入右頸靜脈插管用于輸血及監測中心靜脈壓；分離右側股動脈以及股靜脈并置入導管用于放血及監測平均動脈壓(MAP)。經股靜脈注射肝素200 U/kg，10 min后采用抽血輸血雙向全自動注射泵 BYZ-810D (比揚醫療器械有限公司，中國長沙)經股動脈持續放血1 h，血液收集在20 ml無菌注射器內。失血量為總血容量的50%。觀察1 h后，經30 min由股靜脈回輸全部自體血，建立失血性休克和復蘇模型。自體血回輸結束后觀察2 h，待大鼠清醒后拔除所有導管，縫合傷口，肌肉注射頭孢咪唑預防感染。實驗過程中采用燈照直射維持直腸溫度(38.0±0.5)℃。等待動物翻身反射恢復且清醒后回籠飼養觀察。C組不放血，手術操作同SR組。RIPC組于放血前40 min采用止血帶阻斷雙側后肢血流5 min，松開5 min，反復4次，行遠端肢體缺血預處理，其余操作同SR組。阻斷血流的標準：雙后肢皮膚顏色改變，皮膚溫度下降，止血帶捆綁以下部位超聲監測不到動脈搏動。本實驗方案遵循的程序經過中山大學孫逸仙紀念醫院實驗動物倫理委員會審查討論后批準實行。

三、 心臟彩色多普勒超聲(彩超)

于基礎狀態(BL)、放血結束即刻(S1)、回輸自體血液前(S2)、回輸結束即刻(R1)、回輸后1 h(PR1h)以及2 h(PR2h)，采用HD15彩色超聲儀(飛利浦公司，荷蘭)測量5個心動周期左心室舒張末期內徑(LVEDD)和左心室收縮末期內徑(LVESD)，計算心輸出量、LVEF以及左心室短軸縮短率(FS)，FS=(LVEDD-LVESD)/ LVEDD×100%；測量5個心動周期等容舒張時間(IVRT)、等容收縮時間(IVCT)和射血時間(ET)，計算左心室心肌活動指數(Tei Index)，Tei Index=(IVCT+IVRT)/ET。

四、 心電圖ST變化

采用邁瑞BeneViewT5監護儀監測心電圖和MAP，并利用Windaq生理記錄儀連續記錄大鼠的心電圖、MAP等生理參數。以BL的ST段為基線標準，計算S1，S2，R1，PR1h以及PR2h的ST變化值。

五、 心肌損傷標志物

在BL，S2，PR2h時間點分別抽取動脈血0.5 ml，低溫離心后提取上清液，利用ACCESS 2免疫化學發光儀檢測心肌肌鈣蛋白I(cTnⅠ)濃度。

六、 生存結局

記錄大鼠失血性休克復蘇后72 h的生存結局情況(每組存活率=每組存活大鼠數量/每組實驗大鼠總數)。

七、 統計學處理

結果

一、3組大鼠各個時刻血流動力學以及心功能指標的比較

在BL時刻3組大鼠的生理學指標比較差異無統計學意義(P>0.05)；與對照大鼠C組比較，在S1，S2，R1時刻SR組與RIPC組MAP明顯下降；在S1至PR2h時刻，SR組與RIPC組大鼠的心輸出量、LVEF降低，Tei Index升高(P<0.01)；而FS在S1至R1時明顯升高，在回輸血液復蘇后逐漸下降(P<0.01)。與SR組大鼠比較，RIPC組在S1至PR2h時，MAP、心輸出量和LVEF，FS升高，Tei Index降低(P<0.01)，見表1。

表1

3組大鼠各個時刻血流動力學以及心功能指標的比較±s)

注：與C組比較，aP<0.01，與SR組比較，bP<0.01，與前一時間點比較，cP<0.05/5；1 mm Hg=0.133 kPa

二、3組大鼠各個時刻心電圖ST段變化的比較

與對照大鼠C組比較，在S1至PR2h時SR組與RIPC組ST段較BL明顯偏移(P<0.01)。在S1和S2時，SR組與RIPC組大鼠的ST段明顯下移；在R1至PR2h時，SR組與RIPC組大鼠的ST段明顯上抬； 然而，對比RIPC組大鼠，SR組偏移程度顯著增大(P<0.01)，見表2。

表2

3組大鼠各個時刻心電圖ST段變化的比較±s)

注：與C組比較，aP<0.01;與SR組比較，bP<0.01;與前一時間點比較，cP<0.05/5

三、3組大鼠cTn I濃度的變化結果

C組大鼠的cTn I濃度在BL、S2、PR2h時間點變化沒有統計學差異。SR組以及RIPC組大鼠的cTn I濃度在S2、PR2h明顯高于BL(P<0.01)。然而，cTn I濃度在RIPC組在S2、PR2h低于SR組(P<0.01)，見圖1。

圖1　三組動物不同時間cTnⅠ濃度變化的比較

注：與C組比較，*P<0.01；與SR組比較，#P<0.01；與前一時間點比較，+P<0.05/2

四、72 h生存結局

SR組和RIPC組動物液體復蘇后72 h內存活率分別為2/12和10/12，組間比較差異有統計學意義(P<0.01)。

討論

失血性休克進行液體復蘇后引起的缺血再灌注心肌損傷嚴重程度與出血量和休克時間密切相關[7]。根據既往的研究，利用出血量為總血容量50%，休克時間為1 h的方法制備嚴重的失血性休克模型，并在休克后回輸自體血進行復蘇[8]。而在本實驗中，休克時間延長至2 h。結果表明，動物放血后MAP明顯降低至60 mm Hg以下，提示大鼠失血性休克模型制備成功；回輸自體血后MAP回升至60 mm Hg，提示復蘇成功。

既往研究表明，遠端肢體缺血預處理可以有效保護離體心肌的缺血再灌注損傷，包括改善心肌最大收縮速率，減少心肌的凋亡。參考既往實驗，我們在研究中利用放血前40 min采用止血帶阻斷雙側后肢血流5 min，松開5 min，反復4次的方法進行肢體缺血預處理。我們的結果和既往研究一致表明，遠端肢體缺血預處理有效保護了失血性休克液體復蘇后動物的心功能，提高了復蘇后的心輸出量以及射血分數，并改善了Tei Index以及FS，從而改善了生存預后[5]。

心肌缺血再灌注時，心肌中的氧張力降低或無氧代謝會加強，出現了電位差，即可出現ST段的偏移。在本研究中，大鼠經歷失血性休克后的缺血損傷以后，心電圖首先是在缺血階段出現ST段下移；在液體復蘇再灌注后，出現明顯的心肌損傷，ST段繼而上抬。缺血預處理后，休克后復蘇大鼠的心電圖ST段在缺血階段以及再灌注后ST段的偏移明顯減少。這些結果表明，預處理改善了缺血再灌注的心肌損傷。

cTnⅠ被認為是臨床上診斷心肌損傷和壞死特異性最強、敏感度最高的“ 金指標”，當心肌細胞通透性增加時，cTnⅠ即會從心肌細胞中滲出到血液中，從而使血清cTnⅠ水平明顯升高。本研究顯示，缺血和再灌注損傷后，休克大鼠血清cTnⅠ明顯升高；然而，經過缺血預處理的大鼠cTnⅠ僅輕度增高。因此，經過遠端肢體缺血預處理后，缺血再灌注引起的心肌損傷程度明顯減輕。

綜上所述，遠端肢體缺血預處理可顯著減輕失血性休克液體復蘇后大鼠的心肌缺血再灌注損傷，從而明顯改善了生存預后。

參考文獻

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Effect of remote ischemic pre-conditioning on myocardial ischemic injury in a hemorrhagic shock-reperfusion rat model

LinHui,LiuJuanhua,ZhouTianen,YangZhengfei.

DepartmentofInternalMedicine,HospitalofSouthChinaAgriculturalUniversity,Guangzhou510640,China

【Abstract】ObjectiveCardiac ultrasound, electrocardiogram and measurement of myocardial injury markers were performed to comprehensively investigate the effect of remote ischemic pre-conditioning (RIPC) upon myocardial ischemic injury in a hemorrhagic shock-reperfusion rat model. MethodsThirty six male adult Sprague-Dawley rats, weighing 300-350 g, were randomly divided into the sham control (C), hemorrhagic shock-reperfusion (SR) and RIPC groups (n=12 for each group). Hemorrhagic shock-reperfusion rat models were established by 60-min bleeding (50% of total blood volume) via femoral artery followed by 30-min reperfusion via femoral vein at 1 h later. In the RIPC group, bilateral hind limbs were clamped at 40 min before hemorrhage. The procedure involved four cycles of 5 min of ischemia followed by 5 min of reperfusion. Electrocardiographic tracing and mean arterial pressure (MAP) were continuously recorded for at baseline (BL), immediately after bleeding (S1), before reperfusion (S2) and after reperfusion (R1) and 1 h after reperfusion (PR1h) and 2 h after reperfusion (PR2h, respectively. Cardiac output (CO), left ventricular ejection fraction (LVEF), fractional shortening (FS) and Tei Index were measured by electrocardiogram. The concentration of cardiac troponin I (cTnI) in the arterial blood was measured at BL, S2 and PR2h. The survival of animals was observed at 72 after resuscitation. ResultsCompared with the C group, the MAP, CO and FS in the SR group at S1-PR2h, and in the RIPC group at S1-S2 were significantly decreased whereas Tei Index was considerably elevated (all P<0.01). Compared with the SR group, the MAP, CO and FS were significantly decreased whereas Tei Index was considerably increased in the RIPC group after resuscitation (all P<0.01). From S1 to PR2h, ST-segment depression and cTn I concentration in the SR and RIPC groups were significantly higher than those in the C group (all P<0.01), whereas the degree of increase in the RIPC group was significantly less than that in the SR group (P<0.01). The survival rate after resuscitation in the RIPC group was also significantly higher compared with that in the SR group (P<0.01). ConclusionRIPC effectively alleviates myocardial ischemic injury and significantly enhances prognosis outcomes in a hemorrhagic shock-reperfusion rat model.

【Key words】Shock; Myocardial reperfusion injury; Ischemic pre-conditioning; Cardiac function; Troponin I

(收稿日期：2015-12-06)(本文編輯：楊江瑜)

Corresponding author， Yang Zhengfei, E-mail: yangzhengfei@vip.163.com

通訊作者，楊正飛，E-mail:yangzhengfei@vip.163.com

DOI:10.3969/j.issn.0253-9802.2016.04.006

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