微小RNA-146a rs2910164及微小RNA-499 rs3746444與缺血性腦卒中的關系

呂國天　王爽　王慶坤

321000 東陽，東陽市廣福醫院神經內科(呂國天，王慶坤)；310009 杭州，浙江大學第二附屬醫院神經內科(王爽)

?

微小RNA-146a rs2910164及微小RNA-499 rs3746444與缺血性腦卒中的關系

呂國天王爽王慶坤

321000 東陽，東陽市廣福醫院神經內科(呂國天，王慶坤)；310009 杭州，浙江大學第二附屬醫院神經內科(王爽)

【摘要】目的探討微小RNA(miR)-146a rs2910164和miR-499 rs3746444單核苷酸多態性與缺血性腦卒中的關系。方法采用基因直接測序技術及Taqman-PCR基因分型技術檢測378例缺血性腦卒中患者(病例組)及378名健康人(對照組)miR-146a rs2910164和miR-499 rs3746444位點的等位基因和基因型的頻率分布，采用條件Logistic回歸分析其與缺血性腦卒中的關系。結果病例組的miR-146a rs2910164位點等位基因G頻率分布高于對照組(P=0.003, OR=1.412, 95%CI=1.121～1.716)，基因型GG及CG+GG 的頻率分布也高于對照組(GG：P=0.002, OR=2.080, 95%CI=1.330～3.250；CG+GG：P=0.011, OR=1.488, 95%CI=1.110～2.012)。2組miR-499 rs3746444位點的等位基因與基因型頻率分布比較差異均無統計學意義(P均>0.05)。 結論miR-146a rs2910164單核苷酸多態性可能與缺血性腦卒中相關，miR-499 rs3746444則可能與缺血性腦卒中無關。

【關鍵詞】微小RNA-146a；微小RNA-499；單核苷酸多態性；缺血性腦卒中

缺血性腦卒中是由遺傳因素和環境因素共同作用所致的一種多基因遺傳性復雜疾病，此病發病過程與多基因之間和基因與環境之間的相互作用等有關，與此病相關的基因在其發病過程中發揮單一或聯合作用，它們還可與環境因子共同作用增加此病的發病風險[1]。吸煙、飲酒、高脂飲食、高血壓病、糖尿病等已被證實是此病重要的致病因素[2]。除此之外，大量研究顯示，遺傳因素如相關基因的突變、缺失、遺傳多態性都與缺血性腦卒中的發病相關[3]。研究表明微小RNA(miR)-146a與miR-499參與血管損傷應答過程，可調控血管循環系統中血栓形成或炎癥信號通路中的重要基因的表達，其變異可引起靶基因的功能異常[4-5]。我們推斷其單核苷酸多態性可能是影響缺血性腦卒中的風險因子，故對缺血性腦卒中患者與正常人miR-146a rs2910164及miR-499 rs3746444位點的等位基因及基因型頻率分布情況進行了分析，以初步探討其遺傳多態性與缺血性腦卒中發病的關系。

對象與方法

一、研究對象

將2012年1月至2014年12月在東陽廣福醫院急診科和神經內科就診并經臨床和影像學檢查(CT或MRI)確診的378例缺血性腦卒中患者設為病例組，并將同期在該院體檢的年齡、性別與之相互匹配的378名健康人設為對照組。病例組符合《中國急性缺血性腦卒中診治指南2010》中缺血性腦卒中的診斷標準[6]。對照組排除了新發或既往腦血管病史，且無家族遺傳病史。本研究獲我院醫學倫理委員會批準，研究對象均知情同意。

二、方法

用EDTA抗凝2組的外周血樣。采用基因直接測序技術及Taqman-PCR基因分型技術檢測2組miR-146a rs2910164和miR-499 rs3746444位點等位基因及基因型的頻率分布。

1.DNA提取

采用人類基因組DNA提取試劑盒(北京世紀康為公司)提取各研究對象200 μl EDTA抗凝外周血的人類基因組DNA, 并采用Eppendorf紫外分光光度計檢測提取DNA的濃度和純度，將A260/A280檢測結果為1.8～2.1的樣本放置于-80℃低溫冰箱保存備用。

2.Taqman-PCR

采用Taqman-PCR基因分型技術對miR-146a rs2910164和miR-499 rs3746444進行基因分型，其中rs2910164位點上游引物為5’-GAACTGAATTCCATGGGTTGTGT-3’，下游引物為5’-GCCCACGATGACAGAGATATCC-3’，探針FAM-5’-TCAGACCTGTGAAATT-3’，探針VIC-5’-TCAGACCTCTGAAA-TT-3’；rs3746444位點上游引物為5’-GCTGTTAAGACTTGCAGTGATGTTT-3’，下游引物為R-5’-CGGGAAGCAGCACAGACTT-3’，探針FAM-5’-CCA-CGTGAACGTCACAG-3’，探針VIC-5’-CCACGTGA-ACATCACAG -3’。Taqman-PCR擴增體系總體積為5 μl, 其含有100 ng的基因組DNA模板，2.5 μl的2×TaqMan PCR MasterMix和2.5 μl的20×SNP Assay (包含上下游引物和FAM/VIC 探針)。其反應條件為95℃預變性10 min, 92℃變性15 s, 60℃退火和延伸1 min，上述過程持續40個循環[4]。為驗證Taqman-PCR技術基因分型結果的準確性，本研究采用DNA直接測序技術隨機篩選2組10%的樣本進行檢測分析[4]。

三、統計學處理

計算2組miR-146a rs2910164和miR-499 rs3746444位點的等位基因及基因型頻率，并采用哈代-溫伯格遺傳平衡定律分析抽樣基因型的群體代表性，其中P>0.05時認為抽樣具有群體代表性[7]。采用SPSS 17.0軟件包處理數據，用配對t檢驗分析計量資料，配對χ2檢驗分析計數資料，并采用條件Logistic回歸計算OR。P<0.05為差異有統計學意義。

結果

一、病例組與對照組的一般資料

病例組與對照組高血壓病、糖尿病和肥胖癥百分率的比較差異均具有的統計學意義，且病例組的血脂高于對照組，P均<0.05，見表1。

二、病例組與對照組miR-146a rs2910164與miR-499 rs3736444位點等位基因和基因型頻率分布

DNA直接測序與Taqman-PCR共同分析miR-146a rs2910164與miR-499 rs3736444位點的檢測結果完全一致。miR-146a rs2910164位點的等位基因G在病例組的頻率分布明顯高于對照組，此位點病例組中的基因型GG 、CG+GG 基因型頻率分布也顯著高于對照組(P均<0.05)。miR-499 rs3736444位點的等位基因A、G及基因型AA、AG、GG和AG+GG在2組中的頻率分布比較差異均無統計學意義(P均>0.05)，見表2。 miR-146a rs2910164與miR-499 rs3736444位點在對照組中的頻率分布均符合哈代-溫伯格遺傳平衡定律(miR-146a rs2910164:χ2=3.085,P=0.079; miR-499 rs3736444:χ2=0.245,P=0.621)。

討論

miR是一類長度為21～23個核苷酸的非編碼RNA分子，其不僅在組織器官的生長和發育、細胞增殖和分化中發揮重要作用，而且在多種復雜疾病中發揮重要調控作用[8-10]。此類RNA小分子在人類基因組中所占比例較低，但其可調控人類大約三分之一的基因。miR基因或其前體分子的遺傳變異可能影響miR分子的成熟或與靶基因結合的能力，引發靶基因調控功能紊亂[11]。大量研究也證實miR的單核苷酸多態性與復雜疾病的發生和進展相關[9-10,12-13]。缺血性腦卒中也是一類由遺傳因素和環境因素相互作用誘發的復雜疾病, miR-146a和miR-499也參與缺血性腦卒中相關作用基因的表達調控[4], 而rs2910164和rs3746444分別位于上述兩前體分子序列中，此兩多態性位點可能影響miR-146a和miR-499分子的表達或結構異常。因此，上述兩位點可能與缺血性腦卒中存在相關性。

表1

病例組與對照組的一般資料

表2

miR-146a rs2910164與miR-499 rs3736444位點基因型和等位基因在病例組和對照組中的頻率分布

注：此結果調整了糖尿病、高血壓病、肥胖癥和血脂狀態

在本研究中我們發現，病例組中高血壓病、糖尿病和肥胖癥所占百分率明顯高于對照組，而甘油三酯、膽固醇、LDL和HDL水平與對照組比較差異均有統計學意義，提示糖尿病、高血壓病、肥胖癥和血脂代謝異常可能是缺血性腦卒中疾病的風險因子。進一步分析等位基因和基因型頻率分布的結果顯示，miR-499 rs3746444位點G等位基因、AG、GG和AG+GG基因型與缺血性腦卒中均無統計學相關性，提示此位點可能未參與此病的發生過程，此位點等位基因和基因型均不能作為評估缺血性腦卒中發病的遺傳風險因子。而病例組rs2910164位點的G等位基因、GG和CG+GG基因型頻率明顯高于對照組，說明此位點與缺血性腦卒中有關，提示miR-146可能參與缺血性腦卒中的發病過程，等位基因G和攜帶有等位基因G的基因型GG、CG+GG可能是缺血性腦卒中的遺傳風險因子。本研究結果與Huang等[14]和Zhu等[15]的報道基本一致，而與Liu等[16]的有關296例缺血性腦卒中患者和391名健康對照者的研究結果不同，造成各研究結果不同的可能原因與樣本量小或納入人群的地域、遺傳背景、環境等因素差異有關。rs2910164位點位于前體miR-146分子序列中，其C等位基因與G等位基因的轉換，可引發其成熟miR分子的表達差異，已有研究報道，相對于不攜帶此位點G等位基因的個體，攜帶此位點G等位基因的個體中miR-146的表達水平更低[17]。而高水平的miR-146可以抑制與缺血性腦卒中發病相關的促炎NF-κB和MAP激酶信號通路的激活和TNF-α的表達[18-19]。因此攜帶此位點G等位基因的個體表達較低的miR-146分子，而低水平的miR-146未能有效抑制和調控上述與缺血性腦卒中相關的促炎通路的激活和調節細胞因子的表達，提高了缺血性腦卒中的發病風險。

綜上所述，本研究結果顯示，miR-499 rs3746444位點與缺血性腦卒中可能無關，但miR-146a rs2910164等位基因G及基因型GG和CG+GG可能與缺血性腦卒中有關，可能是缺血性腦卒中的遺傳風險易感因子。

參考文獻

[1]Titov BV, Matveeva NA, Martynov MY, Favorova OO. Ischemic stroke as a complex polygenic disease. Mol Biol (Mosk)，2015, 49(2): 224-248.

[2]韓英俊.缺血性腦卒中危險因素研究進展.中國醫藥科學，2011， 1(14):57-58.

[3]Lemmens R, Hermans S, Nuyens D, Thijs V. Genetics of atrial fibrillation and possible implications for ischemic stroke. Stroke Res Treat, 2011，2011: 208694.

[4]Jeon YJ, Kim OJ, Kim SY, Oh SH, Oh D, Kim OJ, Shin BS, Kim NK.Association of the miR-146a, miR-149, miR-196a2, and miR-499 polymorphisms with ischemic stroke and silent brain infarction risk. Arterioscler Thromb Vasc Biol, 2013，33(2):420-430.

[5]Saugstad JA. Non-coding RNAs in stroke and neuroprotection. Front Neurol, 2015, 13(6):50.

[6]宋水江. 中國缺血性腦卒中防治指南2010解讀. 心腦血管病防治, 2011, 10(5), 11-12.

[7]Shriner D. Approximate and exact tests of Hardy-Weinberg equilibrium using uncertain genotypes. Genet Epidemiol, 2011, 35(7):632-637.

[8]Jonas S, Izaurralde E. Towards a molecular understanding of microRNA-mediated gene silencing. Nat Rev Genet, 2015, 16(7):421-433.

[9]Kaudewitz D , Zampetaki A , Mayr M .MicroRNA biomarkers for coronary artery disease? Curr Atheroscler Rep, 2015, 17 (12 ):70.

[10]岑俊威，曾駿成，周宇. MiR-126 與消化系統疾病關系的研究進展. 新醫學, 2015, 46(10): 645-649.

[11]Hua HB, Yan TT, Sun QM.miRNA polymorphisms and risk of gastric cancer in Asian population.World J Gastroenterol, 2014, 20(19):5700-5707.

[12]Yin KJ, Hamblin M, Chen YE. Angiogenesis-regulating microRNAs and ischemic stroke. Curr Vasc Pharmacol, 2015,13(3):352-365.

[13]Araldi E, Chamorro-Jorganes A, van Solingen C, Fernandez-Hernando C, Suarez Y.Therapeutic potential of modulating microRNAs in atherosclerotic vascular disease.Curr Vasc Pharmacol, 2015,13(3):291-304.

[14]Huang S, Zhou S, Zhang Y, Lv Z, Li S, Xie C, Ke Y, Deng P, Geng Y, Zhang Q, Chu X, Yi Z, Zhang Y, Wu T, Cheng J.Association of the genetic polymorphisms in pre-microRNAs with risk of ischemic stroke in a Chinese population. PLoS One, 2015,10(2):e0117007.

[15]Zhu R, Liu X, He Z, Li Q. miR-146a and miR-196a2 polymorphisms in patients with ischemic stroke in the northern Chinese Han population. Neurochem Res, 2014,39(9):1709-1716.

[16]Liu Y, Ma Y, Zhang B, Wang SX, Wang XM, Yu JM.Genetic polymorphisms in pre-microRNAs and risk of ischemic stroke in a Chinese population. J Mol Neurosci, 2014,52(4):473-480.

[17]Ramkaran P, Khan S, Phulukdaree A, Moodley D, Chuturgoon AA. miR-146a polymorphism influences levels of miR-146a, IRAK-1, and TRAF-6 in young patients with coronary artery disease. Cell Biochem Biophys, 2014,68(2): 259-266.

[18]Cheng HS, Sivachandran N, Lau A, Boudreau E, Zhao JL, Baltimore D, Delgado-Olguin P, Cybulsky MI, Fish JE. MicroRNA-146 represses endothelial activation by inhibiting pro-inflammatory pathways. EMBO Mol Med, 2013, 5(7): 949-966.

[19]Cui G, Wang H, Li R, Zhang L, Li Z, Wang Y, Hui R, Ding H, Wang DW.Polymorphism of tumor necrosis factor alpha (TNFalpha) gene promoter, circulating TNF-alpha level, and cardiovascular risk factor for ischemic stroke. J Neuroinflammation, 2012, 9: 235.

Association of miR-146a rs2910164 and miR-499 rs3746444 polymorphisms with risk of ischemic stroke

LyuGuotian,WangShuang,WangQingkun.

DepartmentofNeurology,GuangfuHospitalofDongyangCity,Dongyang321000,China

【Abstract】ObjectiveTo investigate the association of miR-146a rs2910164 and miR-499 rs3746444 single nucleotide polymorphisms and ischemic stroke. MethodsTaqman-PCR and DNA sequencing assays were performed to investigate the genotype and allele gene of miR-146a rs2910164 and miR-499 rs3746444 loci in 378 patients with ischemic stroke (ischemic stroke group) and 378 healthy individuals (control group). The association of miR-146a rs2910164 and miR-499 rs3746444 single nucleotide polymorphisms with the risk of ischemic stroke was assessed by logistic regression analysis. ResultsIn the ischemic stroke group, the frequency of allele G (P=0.003, OR=1.412, 95%CI=1.121-1.716), genotype GG (P=0.002, OR=2.080, 95%CI=1.330-3.250), CG+GG (P=0.011, OR=1.488, 95%CI=1.110-2.012) of miR-146a rs2910164 was significantly higher compared with those in the control group. However, the frequency of allele gene and genotype of miR-499 rs3746444 did not significantly differ between the ischemic stroke and control groups (both P>0.05). ConclusionsThe single nucleotide polymorphism of miR-146a rs2910164 rather than miR-499 rs3746444 is probably correlated with the risk of ischemic stroke.

【Key words】miRNA-146a; miRNA-499; Single nucleotide polymorphism;Ischemic stroke

(收稿日期：2015-11-19)(本文編輯：洪悅民)

Corresponding author, Lyu Guotian,E-mail:monkeydygf@sina.com

通訊作者，呂國天，E-mail：monkeydygf@sina.com

DOI:10.3969/j.issn.0253-9802.2016.04.012

·臨床研究論著·