Th17細胞及Treg細胞在喉癌外周血中的表達

楊春平+李俐華+羅英+劉紅兵+劉月輝

【摘要】目的：檢測喉鱗狀細胞癌患者外周血Treg細胞和Thl7細胞比例，研究其變化與意義。方法：采用流式細胞技術檢測10例健康對照者和42例喉鱗狀細胞癌患者外周血Treg和Thl7細胞比例，并觀察Th17/Treg在喉癌分期中的變化。結果：與健康對照組比較，喉癌患者外周血Treg細胞和Th17細胞比例明顯升高（P<0.05）；發生淋巴結轉移者較無淋巴結轉移者的Treg和Th17細胞比例增高（P<0.05）；通過分析不同喉癌分期中Th17/Treg細胞的分布，結果發現Ⅲ+Ⅳ期組Th17細胞的比例和Ⅰ+Ⅱ期無明顯差異，而Treg細胞在Ⅲ+Ⅳ期比Ⅰ+Ⅱ期明顯增高（P<0.05）。結論：喉癌外周血中Th17和Treg細胞數量增多，二者比例增高，并隨著疾病的進展而增加，表明二者均參與了喉癌的發生發展過程。

【關鍵詞】喉鱗狀細胞癌；Thl7細胞；Treg細胞；表達

【中圖分類號】R730.6 【文獻標志碼】 A 【文章編號】1007-8517（2016）08-0086-02

Abstract：Objective To investigate Th17 /T regulatory （ Treg） cell ratio in laryngeal cancer.Methods The two T cell subsets were determined in the peripheral blood of 42 patients with laryngeal squamous cell carcinoma（ LSCC） and 10 healthy volunteers by flow cytometry.Results Compared with the healthy controls，patients had a significantly higher proportion of both Th17 and Treg cells.Higher frequencies of Treg and Th17 cells were found in patients with lymph node involvement.Moreover，The results showed that there was no significant difference in the proportion of Th17 cells and the early stage of cells， while the Treg cells were significantly higher than those in group III and IV.Conclusion Our results suggested a counter regulation of Th17and Treg cells maybe involved in the development and progression of LSCC.

Keywords：Laryngeal Squamous Cell Carcinoma； Th17cell； Treg Cell； Expression

喉癌是發病率僅次于鼻咽癌的頭頸部惡性腫瘤。目前采用手術、放化療后生存率有顯著提高，但是部分患者仍有局部復發和轉移。免疫逃逸是腫瘤發生、發展和復發的主要原因，也是體內多種免疫細胞相互作用的結果。其中Thl7細胞及Treg細胞是近年來最受關注的CD4+T細胞亞群，在調節免疫功能中起重要作用，它們在腫瘤形成、發展中的作用和相互關系引起了相關學者的極大興趣。本研究通過檢測不同分期喉癌患者外周血中Th17及 Treg細胞水平的變化，探討二者表達與喉癌發生、發展及變化的關系，為開發新的免疫治療方法提供初步實驗依據。

1資料與方法

1.1一般資料研究對象為2013年1月至12月在南昌大學第二附屬醫院耳鼻咽喉頭頸外科收治的、未經任何治療的男性喉鱗狀細胞癌患者42例，年齡41～75歲，平均年齡（54.2±16.4）歲。根據2002年UICC關于喉癌的分期標準，（Ⅰ+Ⅱ）期18例，（Ⅲ+Ⅳ）期24例，其中頸淋巴結轉移12例。另外以10例健康體檢者作為對照組。受檢者在清晨空腹采取靜脈血2.0ml，肝素鈉抗凝，2000r/min離心10min分離出血清后于-20℃凍存。采用淋巴細胞分離液分離單個核細胞，用于RNA提取和流式細胞術檢測。

1.2主要試劑APC標記的抗人CD4抗體、PE標記的抗人CD25抗體、FITC標記的抗人IL-17、Foxp3抗體（eBioscience公司）、Th17破膜劑（BF公司）、Foxp3檢測專用固定劑和破膜劑（eBioscience公司）、RPMI1640培養基（Hyclone公司）、新生小牛血清（杭州四季青公司）、淋巴細胞分離液（上海朗頓生物科技有限公司）、佛波酯、離子霉素、莫能霉素（Sigma公司）。流式細胞分析儀（BD公司）、BIORAD model 550型酶標儀（伯樂公司）。

1.3實驗方法Th17細胞檢測：調整單個核細胞懸液濃度至1×106ml-1，分別加入50ng/ml（終濃度）佛波酯、1μg/ml離子霉素、1μg/ml BFA及含10%新生小牛血清的1640培養液。37℃、5%CO2培養箱培養6h后收集培養的細胞，1%多聚甲醛固定15min，PBS洗滌、離心5min后棄上清液，加入APC標記的抗人CD4抗體2μl、破膜劑及FITC標記的抗人IL-17抗體，孵育30min后，PBS洗滌后再重懸細胞，轉至流式細胞儀專用管內避光檢測Th17細胞占CD4+T細胞的比例。

Treg細胞檢測：調整單個核細胞懸液濃度至1×106ml-1，取100μl細胞懸液，加入10μl FITC標記的CD4抗體對細胞染色，4℃避光孵育30min，PBS洗滌細胞、然后加入Foxp3檢測專用固定劑和破膜劑孵育洗滌細胞，加入10μl Foxp3單抗，室溫下避光孵育20min，洗滌重懸細胞，上流式細胞儀進行檢測，以CD4和CD25設門，分析門內Foxp3細胞亞群比例。

1.4統計學方法應用SPSS 16.0統計軟件進行分析，計量資料以（x±s）表示，組間比較采用t檢驗，多組間比較用方差分析，P<0.05為差異有統計學意義。

2結果

2.1喉癌組與健康對照組外周血Th17和Treg細胞百分率比較流式細胞術檢測結果顯示喉癌患者組Th17和Treg細胞百分率均明顯高于對照組，差異有統計學意義（P<0.05），見表1；Ⅰ+Ⅱ期組中Th17細胞百分率與Ⅲ+Ⅳ期組比較差異無統計學意義（P>0.05），而Ⅰ+Ⅱ期組中Treg細胞百分率與Ⅲ+Ⅳ期組比較差異有統計學意義（P<0.05），見表2；其中無淋巴結轉移者外周血Th17和Treg細胞百分率均明顯低于淋巴結轉移組，差異有統計學意義（P<0.05）。見表3 。

3討論

免疫逃逸是惡性腫瘤發生、發展、浸潤以及復發的重要原因，腫瘤細胞通過修飾自身表面抗原及改變組織微環境等途徑來逃避自身免疫系統的識別及攻擊，表現為腫瘤局部及外周血中免疫細胞及相關細胞因子之間的平衡被打亂。Th17和Treg細胞是CD4+T細胞重要的細胞亞群，在正常機體內Th17和Treg細胞保持一定的比例，其比例失調就會引起免疫功能低下或免疫耐受，從而導致腫瘤發生、發展，使腫瘤細胞逃避宿主免疫系統的攻擊[1]。Th17細胞通過分泌IL-17在介導細胞外病原體感染、腫瘤、哮喘、移植排斥反應、自身免疫性疾病的發生發展過程中發揮重要作用[2]。有研究發現在腫瘤組織中Th17高表達者預后較差、病死率較高、生存期縮短。Foxp3是控制Treg細胞發育、分化及發揮免疫抑制功能的關鍵細胞因子，既對Treg細胞發揮效應起到“開關”的作用。Treg細胞及其細胞因子參與抑制抗腫瘤免疫，誘導腫瘤局部免疫耐受，通過分泌抑制性細胞因子抑制機體免疫反應。研究發現Treg細胞在外周血中也同樣升高，且數量與腫瘤的進展程度和預后呈負相關[3-5]。

目前，對Th17與Treg細胞在炎癥和自身免疫性疾病中存在失衡現象的研究較多，而在腫瘤中的研究則較少。Kryczek[6]發現隨著腫瘤的進展，Th17和Treg細胞數量均增加，而Treg細胞增加的幅度高于Th17細胞；Li等[7]報道IL-17、Foxp3在肺癌和癌旁組織的表達水平均隨腫瘤分期而上升，提示IL-17、Foxp3可能共同參與促進腫瘤進展；另外的研究也發現肺癌患者外周血中Treg細胞、Treg /Th17比值均高于健康對照組，且晚期患者更明顯[8-9]。

本研究表明，喉癌患者外周血中Th17、Treg細胞水平均較對照組明顯升高，Ⅲ+Ⅳ組高于Ⅰ+Ⅱ組，腫瘤分期越晚，Treg比Th17細胞增多更為明顯。該結果提示，喉癌患者外周血中Th17和Treg細胞水平升高，且與腫瘤分期相關。而Th17細胞在Ⅲ+Ⅳ組中的比例與Ⅰ+Ⅱ組比較無提高，可能是晚期腫瘤通過局部浸潤和血管轉移，致被招募到腫瘤內的Th17細胞又釋放至外周血中，出現晚期患者外周血中IL-17細胞比例比早期患者和健康者增高的現象。該淋巴細胞循環方式導致了外周血IL-17在不同臨床分期患者中的所占比例有所不同。淋巴結轉移組中Th17和 Treg細胞比例也較無淋巴結轉移組升高，表明增多的Treg細胞可能通過介導免疫耐受，一定程度上促進惡性腫瘤的進展。動物研究結果也證實受腫瘤浸潤的淋巴結及外周血的效應T細胞免疫應答，被腫瘤特異性Treg細胞的抑制，導致Treg細胞在局部占優勢促進腫瘤的進展，提示Th17/Treg細胞分化失衡可能參與喉癌的轉移過程[10]。

綜上所述，喉癌外周血中Th17和Treg細胞數量增多，參與了喉癌的發生發展過程，但Th17和Treg細胞在腫瘤微環境內的變化失衡的具體機制及其對臨床干預策略的意義，還有待進一步深入研究。

參考文獻

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（收稿日期：2016.02.03）