呫噸酮衍生物XP—15對BEL—7402細胞線粒體膜電位的影響

陳毅飛　胡龍美　張楠　梁祖鵬　戴支凱

【摘 要】目的：探討呫噸酮并吡啶衍生物9-（2-嗎啡啉乙酰胺基）-7H-吡啶并[4，3-c]呫噸-7-酮（XP-15）對BEL-7402細胞線粒體膜電位的影響。方法：通過MTT法、細胞形態學和克隆實驗觀察XP-15對BEL-7402細胞增殖的影響；用熒光分光光度計檢測線粒體膜電位的影響。結果：高劑量的XP-15能明顯抑制BEL-7402細胞增殖（P<0.05）；對BEL-7402細胞克隆的抑制作用，呈劑量和時間依賴性。XP-15作用后，BEL-7402細胞的線粒體膜電位降低（P<0.05）。結論：XP-15誘導BEL-7402細胞凋亡的作用，可能與其降低線粒體膜電位有關。

【關鍵詞】9-（2-嗎啡啉乙酰胺基）-7H-吡啶并[4，3-c]呫噸-7-酮；人肝癌BEL-7402細胞；線粒體膜電位

Effect of xanthono-pyridine derivative XP-15 on Human Gastric Carcinoma BEL-7402 cells

CHEN Yi-fei1 HU Long-mei2 ZHANG Nan2 LIANG Zu-peng2 DAI Zhi-kai1

（1.Department of Pharmacology， Pharmaceutical Institute of Guilin Medical College， Guilin Guangxi 541004， China；

2.Department of Pharmacology， Guilin Medical College， Guilin Guangxi 541004， China）

【Abstract】Objective： To investigate mitochondria membrane potential effect of a new xanthono-pyridine derivative 2-morpholino-N-（7-oxo-7H-chromeno[3，2-h]quinolin-9-yl）acetamide（XP-15）on Human Gastric Carcinoma cell line BEL-7402. Methods： Antiproliferative effect of XP-15 on BEL-7402 cells was evaluated by MTT assay， morphological examination and colonial assay. Intracellular mitochondria membrane potential were detected by fluorospectrophotometer. Results： XP-15 could inhibit proliferation of BEL-7402 cells in dose- and time-dependent manner（P<0.05）. After treated with XP-15， mitochondria membrane potential（P<0.05）of BEL-7402 cells were decreased. Conclusion： XP-15 inducing BEL-7402 cells apoptosis might be associated with decreasing mitochondria membrane potential.

【Key words】2-morpholino-N-（7-oxo-7H-chromeno[3，2-h]quinolin-9-yl）acetamide； Human hepatoma BEL-7402 cell line； Mitochondria membrane potential

以呫噸酮（xanthone，氧雜蒽酮） 為母體的化合物主要存在于藤黃科、遠志科、桑科等植物中，是近代天然產物中一類重要的活性成分。在傳統醫學中，含呫噸酮類化合物的藥材早已用于多種疾病的治療[1]。有研究結果顯示，呫噸酮類化合物具有抗腫瘤、調節機體免疫、抗炎、降血壓、抗氧化、抗血栓形成、抗HIV-1及延緩神經系統退行性疾病進程等活性[2]。腫瘤是臨床上的常見病、多發病，目前臨床治療效果尚不理想。呫噸酮類化合物的抗腫瘤應用前景，已引起了醫藥學界的關注，但相關研究較少[3-5]。因此，利用現代藥理學方法，從分離或合成的呫噸酮類化合物中篩選出具有活性的先導化合物，并采用化學修飾等手段，使之成為廣譜、高靶向、低毒的抗腫瘤藥物，已成為呫噸酮類化合物抗腫瘤研究的當務之急[6]。我們合成了呫噸酮衍生物9-（2-嗎啡啉乙酰胺基）-7H-吡啶并[4，3-c]呫噸-7-酮[2-morpholino-N-（7-oxo-7H-chromeno[3，2-h]quinolin-9-yl）acetamide）， XP-15][7]。本研究以人肝癌細胞株BEL-7402為對象，初步探索了XP-15抗腫瘤的可能作用機制。

1 材料和方法[8]

1.1 材料

人肝癌BEL-7402株由中國科學院上海生命科學研究院細胞資源中心提供。胎牛血清購自杭州四季青生物工程材料有限公司；RPMI-1640 培養基為Gibco產品。5氟尿嘧啶（FU）購自上海旭東海普藥業有限責任公司。Trizol Regent和Prime ScriptTM RT reagent kit：寶生物工程（大連）有限公司；胰蛋白酶、噻唑藍（MTT）、二甲基亞砜（DMSO）、Fura-2/AM、Hoechest33258、羅丹明123（R123）和碘化丙啶（PI）均為Sigma公司產品； POWER SYBR？誖GREEN PCR Master Mix：Applied Biosystems，Foster City， CA。550型酶標儀：BioTek Instruments， Inc. USA；DM4000b型熒光顯微鏡：Leica Microsystems Ltd.， Germany；TU1810型紫外可見分光光度計：熒光分光光度計：Cary Eclipse，Australia；北京普析儀器有限責任公司；iQ5 Multicolor Real-Time PCR Detection System：BioRad Laboratories， Inc.，USA；Mastercycler Gradient Cycler：Eppendorf AG，Germany。

1.2 方法

1.2.1 細胞培養

將BEL-7402細胞接種于含10%胎牛血清的RPMI-1640培養基中，于37℃，5% CO2培養箱中培養。在細胞指數生長期時，胰蛋白酶消化，傳代培養。

1.2.2 MTT法與培養細胞的觀察

5×104·mL-1的BEL-7402細胞接種于96孔板，每孔180μL，分為空白對照組（Control，RPMI 1640）、陽性對照組（FU，100μmol/L，RPMI 1640配制）和5個10倍梯度的試藥組（0.01-100μmol/L，RPMI 1640配制），每組設4個平行孔。在結束培養（24h、48h和72h）前4h，加入5 g/L的MTT。結束培養后，棄上清液，每孔加入150μL DMSO，37℃孵育15min，用酶標儀在490 nm檢測各孔的吸光值（absorbance value，A value）。計算細胞存活率。重復3次。同時，倒置顯微鏡下觀察藥物作用72h后的細胞形態。

1.2.3 細胞克隆

用細胞克隆實驗檢測XP-15對BEL-7402細胞的長期毒性作用。將指數生長期細胞接種在6孔板，每孔400個細胞。次日，分組給藥，24h后，換成無藥的完全培養基，在5% CO2、37℃培養箱中培養10d后，在倒置顯微鏡下計數細胞集落數（每個集落的細胞數大于50個細胞）。計算各給藥組的克隆百分比，克隆百分比=給藥組的克隆數/陰性對照組的克隆數×100%。

1.2.4 線粒體膜電位（mitochondrial membrane potential， Δψm） 測定

膜通透性的陽離子熒光染料R123可擴散進入細胞，聚集于帶負電位的線粒體，結合基質蛋白后其熒光即淬滅。線粒體膜去極化時，R123釋放進入細胞漿，R123熒光恢復。因此，R123熒光強度能反映線粒體膜去極化程度[10]。對數生長期細胞加入500 nmol/L的R123、37°C避光負載30 min后，D-Hanks洗3遍，再用D-Hanks液重懸細胞至4×105·mL-1。熒光分光光度計測定熒光強度（激發波長488 nm，發射波長535 nm）。熒光強度穩定后，加入XP-15。實驗結果用給藥前的平均熒光強度進行標準化。

1.2.5 統計學分析

2 實驗結果

2.1 XP-15對BEL-7402細胞體外增殖的影響

XP-15作用BEL-7402細胞72 h的后（見圖1），空白組組細胞形態清晰，密度高。與空白組比，XP-15 100μmol/L劑量組出現細胞碎片，可見貼壁或懸浮的體積縮小的圓形細胞。MTT檢測顯示（圖2A），隨給藥劑量的增加和作用時間的延長，BEL-7402細胞的存活率逐漸降低。細胞克隆檢測顯示（圖2B），隨XP-15劑量的增加，BEL-7402細胞克隆數逐漸減少，其中，XP-15的10μmol/L和100μmol/L組的克隆形成率顯著降低。

2.2 Δψm的測定

R123熒光強度檢測顯示（圖3），隨XP-15劑量的增加，R123熒光強度逐漸下降。空白對照組的平均熒光強度（a.u.）為20.33±0.25，10μmol/L、50μmol/L和100μmol/L的XP-15作用后的平均熒光強度分別為20.31±0.36（P>0.05）、20.21±0.52和19.86±0.86，均低于空白對照組（P<0.05）。

3 討論

呫噸酮類化合物具有誘導腫瘤細胞凋亡、阻滯細胞增殖周期和逆轉腫瘤細胞的耐藥性等生物學活性，在治療腫瘤方面極具前景[3，6]。為尋找抗腫瘤活性的先導化合物，我們合成了呫噸酮并吡啶衍生物XP-15[7]。結果顯示，100μmol/L 的XP-15對BEL-7402細胞增殖的抑制作用明顯。隨XP-15劑量的增加和作用時間的延長，10μmol/L和100μmol/L的XP-15對BEL-7402細胞克隆的抑制作用明顯。以上研究結果提示，XP-15能通過誘導細胞凋亡抑制BEL-7402細胞的增殖。

線粒體功能紊亂也是導致細胞凋亡的的關鍵環節之一。線粒體膜通透性增加時，可引起線粒體膜電位下降，繼而促凋亡因子（如Bad等）的釋放、細胞氧化或磷酸化功能障礙，激活細胞凋亡信號通路，最終導致細胞凋亡[8]。本研究的結果顯示，XP-15可以劑量依賴性地降低線粒體膜電位，表明XP-15誘導BEL-7402細胞的凋亡可能與其降低線粒體膜電位有關。

綜上所述，XP-15能誘導BEL-7402細胞凋亡的作用，可能與其線粒體膜電位， XP-15抗腫瘤機制有待進一步研究。

【參考文獻】

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[責任編輯：楊玉潔]