一株植物內生放線菌次級代謝產物的提取及抑菌活性研究

李增政　林滕　常永芳　周琴　劉俊林

【摘 要】通過從蘭州百合中分離篩選得到的一株放線菌，且發現該菌株具有抑菌活性。本實驗通過發酵來生產次級代謝產物，利用萃取的方法來提取次級代謝產物。用不同溶劑來溶解粗提物以及用菌體進行抑菌活性實驗。最后得到該菌株的發酵產物且該產物對多種不同病原菌（如金黃色葡萄球菌、糞腸球菌、大腸桿菌、綠膿桿菌等）具有較強的抑制作用。

【關鍵詞】放線菌；次級代謝產物；抑菌活性；發酵；生理生化

0 前言

放線菌（Actinomycetes）是一類具有分支狀菌絲體的高（G+C）mol%、革蘭氏陽性細菌。在系統分類學中，分類學家將它分到細菌界、放線菌門、放線菌綱、放線菌目、放線菌科，放線菌屬。目前已描述的放線菌至少有180個屬，包括鏈霉菌屬、諾卡氏菌屬、放線菌屬、小單孢菌屬、鏈孢囊菌屬、游動放線菌屬等；其中研究最多的就是鏈霉菌屬，因為該屬主要用于生產抗生素，而且易于培養。因此，將除此屬以外的其他屬稱作稀有放線菌。從放線菌中發現的生物活性物質至少有11000多種。前已發現的近萬種抗生素，如各種抗癌劑、酶抑制劑、抗寄生蟲劑、免疫抑制劑和農用殺蟲劑等，約70%是由放線菌產生的，其中約三分之二的抗生素來源于陸生放線菌。放線菌與人們的生活息息相關，其代謝活性物質已廣泛應用于現實生活中，如鏈霉素、萬古霉素和阿奇霉素等被廣泛應用于臨床治療，井岡霉素、慶豐霉素等成為農用抗生素。此外，還可用于烴類發酵、石油脫蠟、淄體轉化、污水處理等。

次級代謝產物是指生物生長到一定階段后通過次級代謝合成的分子結構十分復雜、對該生物無明顯生理功能，或并非是該生物生長和繁殖所必需的小分子物質，如抗生素、毒素、激素、色素等。不同種類的生物所產生的次級代謝產物不相同，它們可能積累在細胞內，也可能排到外環境中。由于次級代謝產物大多具有生物活性，因此具有很大研究價值。

微生物在穩定期活菌數目達到高峰期，細胞內大量積累代謝產物，特別是次級代謝產物。有機物被生物體氧化降解成氧化產物并釋放能量的過程統稱為生物氧化。微生物生理學把生物氧化區分為呼吸和發酵，呼吸又可進一步區分為有氧呼吸和無氧呼吸。因此，發酵是生物氧化的一種方式。

發酵是這樣一種生物氧化方式：在沒有外源最終電子受體的條件下，化能異養型微生物細胞對能源有機化合物的氧化與內源的（已經經過該細胞代謝的）有機化合物的還原相耦合，一般并不發生經包含細胞色素等的電子傳遞鏈上的電子傳遞和電子傳遞磷酸化，而是通過底物（激酶的底物）水平磷酸化來獲得代謝能ATP；能源有機化合物釋放的電子的一級電子載體NAD，以NADH的形式直接將電子交給內源的有機電子受體而再生成NAD，同時將后者還原成發酵產物（不完全氧化的產物）。

細胞中的NAD是有限的，如果作為一級電子載體的輔酶NAD不能得到再生，就不能被回用，有效的電子載體就會愈來愈少，脫氫反應就不能持續進行下去了。因此，輔酶NAD的再生是生物氧化（包括發酵）繼續進行下去的必要條件。

該菌株是蘭州百合的內生菌株，本實驗通過采用組織懸液法處理植物組織然后分別接種于改良高氏I號、腐殖酸培養基等10種培養基，在改良高氏I號中分離純化得到一株菌體為紅色形態特征明顯的放線菌菌株。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 目標菌株

從蘭州百合中分離所得的一株放線菌。

1.1.2 主要試劑和藥品

75%乙醇溶液、10%的碳酸氫鈉溶液、生理鹽水、大量高溫滅菌的蒸餾水、無水乙醇、無水乙酸乙酯、甘油、磷酸氫二鉀、硫酸鎂、硫酸鋅、硫酸銅、硫酸亞鐵、硫酸錳、氯化鉀、氯化鈉、氯化鈣、重鉻酸鉀、制霉菌素、放線菌酮、萘啶酮酸等。

1.1.3 主要器材及儀器

9cm培養皿、剪刀、鑷子、酒精燈、酒精棉球、移液槍、槍頭（藍色、黃色）、超凈工作臺、恒溫培養箱、PH計、蒸汽滅菌鍋、搖床培養箱、1000ml錐形瓶、濾紙、打孔器、離心機、旋轉蒸發儀、冷凍干燥機等。

1.2 實驗方法

1.2.1 培養基及抑菌劑的配制

改良高氏I號：可溶性淀粉20g；K2HPO4·3H2O，0.5g；MgSO4· 7H2O，0.5g；FeSO4·7H2O，0.01g；KNO31g；NaCl0.5g；Distilled water1000ml；瓊脂18g。

抑菌劑：重鉻酸鉀（50μg/mL）、萘啶酮酸（20μg/mL）、放線菌酮（50μg/mL）、制霉菌素（50μg/mL）。

發酵種子培養基：可溶性淀粉15g、葡萄糖5g、黃豆粉10g、氯化鈉1g、蛋白胨5g、酵母提取物5g、碳酸鈣5g、蒸餾水1000ml，PH7。

發酵培養基：黃豆餅粉20g、酵母粉15g、葡萄糖10g、K2HPO41g、碳酸鈣3g、氯化鈉1g、蒸餾水1000mL，PH7.2左右。

1.2.2 放線菌的培養及目標菌株的分離純化

將涂布后的平板，置于培養箱中培養，溫度為23℃，時間為30d。在改良高氏I號固體培養基上發現一株菌體為紅色且形態特征明顯的放線菌。將該菌株從原平板上分離接種于新的改良高氏I號固體培養基上，得到純培養平板。

1.2.3 發酵

從生長到對數期的平板中挑取一定數量的單個菌落接種于種子培養基中培養，種子培養基于搖床中160r/min培養溫度26℃培養時間2d。種子培養基占發酵培養基的10%。

將活化兩天以后的種子培養基接種于發酵培養基中，溫度26℃ PH7.2置于160r/min搖床中發酵14d。

1.2.4 次級代謝產物的提取

將發酵液取出搖勻于4℃4000r離心10分鐘，分離上清液和沉淀。上清液用乙酸乙酯按照1：1的比例進行萃取，萃取完全以后分離有機相，將有機相通過旋轉蒸發得到粗提物，再將粗提物于冷凍干燥機中冷凍干燥得到粗提物干品（胞外產物）。沉淀于80%丙酮中浸泡并且用超聲波破碎，然后于4℃4000r離心10分鐘，分離上清液和沉淀。上清液用乙酸乙酯按照1：1的比例進行萃取，萃取完全以后分離有機相，將有機相旋轉蒸發得到粗提物，再將粗提物于冷凍干燥機中冷凍干燥得到粗提物干品（胞內產物）。本試驗主要以胞外產物為研究對象。

1.2.5 抑菌活性

表1 次級代謝產物對細菌的抑菌活性結果

注：濾紙片直徑為10mm結果中的抑菌直徑包括濾紙品直徑，一號溶劑為無菌蒸餾水，二號溶劑為乙醇，三號溶劑為乙酸乙酯.在做抑菌活性實驗時乙醇、乙酸乙酯已揮發，對照（未加粗提物的乙醇、乙酸乙酯）中也沒有出現抑菌圈.抑菌活性實驗用無菌濾紙片法來操作，將次級代謝產物（胞外產物）分別稱取0.05g溶于1ml蒸餾水、乙醇、乙酸乙酯溶劑，每個溶劑做3個平行最后取平均值（表1）。

1.3 結論及分析

該植物內生放線菌的發酵產物粗品對腐生桿菌、綠膿桿菌、大腸桿菌（野生型）、金黃色葡萄球菌（ATCC）、糞腸球菌、β-丙酰均有不同抑制作用；在污染的平板中發現該菌株對青霉菌、黑曲霉具有明顯的拮抗作用。說明應用本實驗中的方法發酵和提取發酵產物是可行的，而且該菌株產生的次級代謝產物對腐生桿菌、綠膿桿菌、大腸桿菌（野生型）、金黃色葡萄球菌（ATCC）、糞腸球菌、β-丙酰這些病原菌具有抑制作用。

所得產物在水、乙醇、乙酸乙酯三種溶劑中具有不同的溶解度，從整體的抑菌效果上來看溶解于乙酸乙酯的效果是最好的，乙醇次之，水最弱，當然不同的菌還是有差異例如大腸桿菌，造成這種現象可能是發酵產物中具有生物活性的物質有多種，這些物質對不同的菌有不同的抑制作用并且這些物質對溶劑的選擇具有一定的條件性。

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[責任編輯：王楠]