參附注射液對膿毒癥大鼠肺損傷的保護作用

黃約諾 黃立搜 徐鵬 陳素珍 樓黎明

[摘要] 目的 探討參附注射液對膿毒癥大鼠肺損傷的保護作用。 方法 采用盲腸結扎穿孔術（CLP） 建立大鼠膿毒癥模型。健康成年雄性SD大鼠72只，隨機分為三組，每組24只：假手術組、膿毒癥組、參附干預組。動物模型制備成功后，各組在腹腔注入參附注射液（10 mL/kg）或等量生理鹽水后，于術后3 h、12 h和24 h檢測肺組織勻漿標本超氧化物歧化酶（SOD）、谷胱甘肽過氧化物酶（GSH-Px）、黃嘌呤氧化酶（XO）活力和丙二醛（MDA）含量。結果 與膿毒癥組比較，參附干預組大鼠肺組織SOD、GSH-Px活性顯著升高（P<0.01），而XO、MDA水平顯著降低（P<0.01）。 結論 參附注射液可通過減少肺氧自由基的產生，減輕肺損傷。

[關鍵詞] 參附注射液；膿毒癥；肺損傷；超氧化物歧化酶；谷胱甘肽過氧化物酶；黃嘌呤氧化酶；丙二醛

[中圖分類號] R459.7 [文獻標識碼] A [文章編號] 1673-9701（2016）06-0026-03

Protective effects of Shenfu injection on lung injury in rats with sepsis

HUANG Yuenuo HUANG Lisou XU Peng CHEN Suzhen LOU Liming

Department of Respiratory Diseases， the Third Hospital Affiliated to Zhejiang Chinese Medical University， Hangzhou 310005， China

[Abstract] Objective To investigate the protective effects of Shenfu injection on pulmonary injury induced by sepsis in rats. Methods Cecal ligation and puncture（CLP） model was used to generate sepsis in rats. SD 72 male rats were randomly divided into three groups with 24 cases in each group： sham operation group， sepsis group， Shenfu intervention group. After generating the animal model groups successfully， injecting Shenfu injection（10 mL/kg） or normal saline in the abdominal cavity， superoxide dismutase （SOD）， glutathione peroxidase （GSH-Px）， xanthine oxidase （XO） activity， malondialdehyde（MDA） contents in lung tissue homogenate were observed 3 hours， 12 hours and 24 hours after CLP. Results Compared with the sepsis group， rats lung tissue SOD， GSH-PX activity of Shenfu intervention group significantly increased（P<0.01）， and XO and MDA levels significantly reduced（P<0.01）. Conclusion Shenfu injection can reduce the pulmonary injury by decreasing the production of oxygen free radicals.

[Key words] Shenfu injection； Sepsis； Pulmonary injury； Superoxide dismutase（SOD）； Glutathione peroxidase（GSH-Px）； Xanthine oxidase（XO）； Malondialdehyde（MDA）

膿毒癥是臨床上常見的急危重癥之一，除可引起劇烈的全身炎癥反應外，還可導致多臟器功能不全。在眾多膿毒癥并發的器官損傷中，膿毒癥導致的急性肺損傷（acute lung injury，ALI）發生早、病情重，是加速患者死亡的重要原因之一[1]。盲腸結扎穿孔術（CLP）模型是目前公認的膿毒癥模型[2]，廣泛應用于基礎研究。參附注射液在臨床上廣泛應用于危重患者的救治，本研究采用CLP制備大鼠膿毒癥模型，觀察參附注射液對膿毒癥大鼠肺損傷的保護作用機制，現報道如下。

1 材料與方法

1.1 一般材料

健康成年雄性SD大鼠72只，體重量280～350 g，由浙江中醫藥大學動物實驗中心提供，實驗動物合格證號：SCXK（滬）2013-0016。

1.2 藥物與試劑

參附注射液（規格：50 mL/瓶，批號：15130064175，雅安三九藥業有限公司）；黃嘌呤氧化酶（xanthine oxidase，XO）試劑盒：生產公司：美國RND公司，批號：R3201L。丙二醛（malondialdehyde，MDA）試劑盒：生產公司：美國RND公司，批號：R4785L。超氧化物歧化酶 （superoxide dismutase，SOD）試劑盒：生產公司：美國RND公司，批號：R4421L。谷胱甘肽過氧物酶（glutathione peroxidase，GSH-Px）試劑盒：生產公司：美國RND公司，批號：R7098L。

1.3 分組及模型制備

健康成年雄性SD大鼠72只，隨機分為三組，每組24只：假手術組、膿毒癥組、參附干預組。采用胡丹丹等[3]建立的CLP法制備大鼠膿毒癥模型，動物模型制備成功后，各組在腹腔注入參附注射液（10 mL/kg）或等量生理鹽水。

1.4 標本采集

術后3 h、12 h和24 h各組分別取8只大鼠，給予10%水合氯醛（0.3 mL/100 g）腹腔注射進行麻醉，經腹主動脈采血處死。處死大鼠后，留取左肺固定于4%甲醛中準備石蠟包埋切片行HE染色，留取右肺置于-70℃冰箱，用于制作肺組織勻漿。采用酶聯免疫吸附（ELISA）法檢測肺組織勻漿標本黃嘌呤氧化酶（XO）、丙二醛（MDA）、超氧化物歧化酶（SOD）和谷胱甘肽過氧化物酶（GSH-Px）的含量。

1.5 肺組織病理改變

將取出的肺組織、用梯度酒精脫水、浸蠟和包埋，制成石蠟塊，用蘇木素染色，鹽酸酒精分化及自來水返藍，之后伊紅染色，再次脫水、透明、封片，于顯微鏡下觀察炎癥細胞浸潤，光學顯微鏡下進行肺組織病理觀察。

1.6 統計學方法

所有數據應用SPSS 17.0統計學軟件進行數據處理，計量資料用均數±標準差（x±s）表示，組間比較采用單因素方差分析，P<0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 各組大鼠肺組織病理結果

假手術組肺組織結構完整，肺泡腔清晰，水腫和炎癥滲出少；隨著時間的推移，與假手術組比較，模型組肺組織可見炎性細胞浸潤逐漸加重，肺水腫、出血以及肺不張逐漸加重，肺泡間隔逐漸增厚并破壞；參附干預組肺組織可見炎性細胞浸潤逐漸減輕，肺水腫、出血以及肺不張逐漸減輕，肺泡間隔逐漸修復。見封三圖4。

2.2 各組大鼠肺組織中XO、MDA、SOD、GSH-Px的含量比較

與假手術組比較，膿毒癥組大鼠肺組織XO、MDA含量顯著升高，SOD、GSH-Px含量顯著降低（P<0.01）；與膿毒癥組比較，參附干預組大鼠肺組織XO、MDA含量顯著降低，SOD、GSH-Px含量顯著升高，差異均有高度統計學意義（P<0.01）。見表1。

3 討論

膿毒癥是臨床常見的危重癥，是由細菌感染引起的全身炎癥反應（SRIS）最常見的并發癥，具有高發病率、高死亡率等特點[4]，導致肺、腎、肝、腸道等多臟器功能障礙，而肺往往是最早、最易受損的靶器官，因此，膿毒癥肺損傷往往是最常見的死亡原因[5]，表現為急性肺損傷或急性呼吸窘迫綜合征。目前其機制尚未完全明了，且缺乏針對性的干預措施，所以研究膿毒癥導致肺損傷機制及其治療具有重要的意義[6]。

氧化應激在膿毒癥的發生、發展中起了重要的作用，氧化應激產生的自由基破壞細胞的結構和功能。氧化應激不但氧化蛋白質，改變蛋白質活性，導致蛋白酶釋放，使抗氧化劑和抗蛋白酶失活，而且可以直接損傷DNA導致斷裂和點突變；導致脂質過氧化，產生血管活性物質和前炎性物質，導致肺微血管完整性和肺泡屏障破壞，引起肺表面活性物質減少，從而導致急性肺損傷的發生[7]。黃嘌呤氧化酶（xanthine oxidase，XO）是嘌呤核苷酸的分解代謝酶， 反映缺氧損傷的情況[8]。急性肺損傷時，機體內XO活性增高， 則氧自由基生成增多。丙二醛（malondialdehyde，MDA）反映體內氧自由基生成量及活性，間接反映細胞受損的程度[9]。MDA含量增加表明CLP術后氧自由基產生增多，細胞膜脂質過氧化增多，肺泡細胞受損[10]。超氧化物歧化酶 （superoxide dismutase，SOD）是重要的抗氧化酶，具有保護肺損傷的作用[11]。胞外SOD 的活性水平與肺損傷的程度呈負相關[12，13]，而氧化應激產物可降低SOD活性[14]。谷胱甘肽過氧物酶（glutathione peroxidase，GSH-Px）是氧自由基清除酶，是肺組織重要的抗氧化防御因子，保護機體免受脂質過氧化物的損害[15]，從而保護細胞膜的結構及功能不受過氧化物的干擾及損害。

中醫學雖然沒有膿毒癥、急性肺損傷（ALI）、急性呼吸窘迫綜合征（ARDS）等病名，但根據其臨床表現：咳嗽咳痰、氣急、進行性呼吸困難、氣促喘憋、紫紺等肺氣壅遏的癥狀，將其歸屬于中醫學的溫病的范圍，病機為外感溫熱毒邪，邪侵犯于肺，熱入陽明，邪與腸中積滯相結，導致熱結腸燥，氣滯壅結，上逆則喘，中阻則滿，邪熱迫瘀，瘀與熱互結，毒邪瘀積，壅滯在肺，致肺失司，失通調水道功能，而水液內停，從而出現肺氣壅遏等癥狀[16，17]。且認為其根本病因為正氣不足，邪氣盛實?！端貑栠z篇·刺法論》說：“正氣存內，邪不可干”，《素問·評熱病論》說：“邪之所湊，其氣必虛”，從根本上闡述了疾病的發生及發展的內在因素——“正虛”，同時也為防治膿毒癥及膿毒癥器官損傷提供了理論依據——“扶正祛邪”[18]。

參附注射液是由中醫方劑“參附湯”科學有效分離提取而制成的中成藥注射劑，其組方來源于《濟生續方》之參附湯，由人參和炮附子組成。具有回陽救逆，益氣固脫等作用，臨床上主要應用于陽氣暴脫之厥脫證，或陽氣虛所致的驚悸、怔忡、喘、咳、胃痛病、泄瀉病、痹證等疾病。方中人參：性味甘溫，具有振奮元氣，益氣固脫，回陽救急的功效，又善于補氣生血，補益肺脾，故有“扶正補虛之第一要藥”之稱，《神農本草經》 謂其“主補五臟， 安精神……除邪氣”，現代藥理研究發現，人參含有多種人參皂苷，具有抗疲勞、抗休克、促進蛋白質的合成及增強機體免疫力的功效。炮附子：性味辛熱，純陽燥烈，補火助陽，可通行十二經脈，溫一身之陽氣，上助心陽以通脈，下補腎陽以益火，有“回陽救逆第一藥”之稱，《本草綱目》謂其“治三陰傷寒……中寒中風，痰厥氣厥”，現代藥理研究發現，炮附子含有烏頭類生物堿，具有抗休克、擴充血管、增加血流、改善循環的作用，其對急性炎癥模型有明顯抑制作用[19]。二藥相配伍而使用，人參不僅可以制約附子的毒性，又可增強附子的功效，二者相合發揮增效減毒之妙[20]。正如晚清名醫鄭肖巖稱參附湯為“扶危之至寶，救急之靈丹”[21]。

既往研究發現其具有抗缺血、抗缺氧、清除氧自由基、抗脂質過氧化等作用，反映了參附注射液對膿毒癥時組織氧自由基損傷的保護作用。我們的研究顯示，CLP能使大鼠體內抗氧化功能下降，自由基產生過氧化反應增加，膿毒癥大鼠體內存在氧化損傷，大量SOD、GSH-Px被自由基滅活；參附注射液各劑量組大鼠肺組織SOD、GSH-Px的生物活性明顯增強。已有研究顯示氧化應激在急性肺損傷發病中起關鍵作用，抗氧化劑對急性肺損傷有保護作用[22]。通過藥物從細胞及分子水平抗氧化應激對治療急性肺損傷是有現實意義的。對于急性肺損傷，參附注射液具有一定的保護膿毒癥肺損傷的作用。其機制可能是通過加強肺組織的抗氧化酶的活性，減少氧自由基的產生，減輕脂質過氧化有關。雖然近年國內外眾多學者對膿毒癥的發病機制及治療進行大量的研究。但由于膿毒癥發病機制過于復雜，其具體機制有待進一步研究。

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（收稿日期：2015-12-25）