免疫分析法檢測真菌毒素

王琳　王雪　田靜秒　宋云飛

【摘要】檢測谷物中常見的真菌毒素。使用酶聯免疫分析法檢測黃曲霉毒素B1，嘔吐毒素，玉米赤霉烯酮。黃曲霉毒素B1，嘔吐毒素，玉米赤霉烯酮ELISA檢測試劑盒的標準曲線的IC50分別為0.14，20.4，0.58 ng/mL。上述三種真菌毒素的添加濃度分別為5，500，25 ng/g，平均添加回收率分別為89.2%，94.8%，83.6%。該方法操作簡便，準確性好，滿足國家限量標準的要求。

【關鍵詞】免疫分析黃曲霉毒素B1嘔吐毒素玉米赤霉烯酮

引言

真菌毒素是是由微生物產生的毒素及毒素代謝產物，對人類健康能夠產生嚴重危害。常見的真菌毒素有黃曲霉毒素，嘔吐毒素，玉米赤霉烯酮等。

黃曲霉毒素被世界衛生組織（WHO）的癌癥研究機構劃定為1類致癌物，是一種毒性極強的劇毒物質。在天然污染的食品中以黃曲霉毒素B1最為多見，其毒性和致癌性也最強[1]。嘔吐毒素（Vomitoxin）又稱脫氧雪腐鐮刀菌烯醇（deoxynivalenol，DON），具有很高的細胞毒素及免疫抑制性質，對人類和動物都有很大危害，可以導致厭食、嘔吐、腹瀉、發燒、頭暈、腹痛等急性中毒癥狀[2]。玉米赤霉烯酮為2，4-二羥基苯甲酸內酯類化合物，具有很強的雌性激素作用，可引起動物的雌激素過多癥和嚴重的生殖道癥狀及不孕癥，還具有免疫毒性、肝毒性等，對腫瘤發生也有一定作用[3]。

因此，國家對真菌毒素制定了嚴格的限量標準，我國規定黃曲霉毒素B1在玉米及其制品中不得超過20 μg/kg，在大米等谷物中不得超過10 μg/kg，在小麥等谷物中不得超過5 μg/kg，脫氧雪腐鐮刀菌烯醇在谷物及其制品中不得超過1000 μg/kg，玉米赤霉烯酮在谷物及其制品中不得超過60 μg/kg[4]。

酶聯免疫分析法檢測真菌毒素具有靈敏度高，檢測時間短，操作簡便，能夠批量檢測，便于現場大量樣品快速篩查等優勢。 本研究建立一種酶聯免疫分析法，用于檢測黃曲霉毒素B1，嘔吐毒素，玉米赤霉烯酮，方法簡便，準確度高，為進一步研究生物毒素的快速檢測方法奠定了基礎。

1 材料與設備

1.1 試劑與材料

黃曲霉毒素B1 ELISA檢測試劑盒，嘔吐毒素ELISA檢測試劑盒，與玉米赤霉烯酮ELISA檢測試劑盒，來自北京普析通用儀器有限責任公司。其他化學試劑購于西隴化工股份有限公司。

1.2 設備

酶標儀，北京普析通用儀器有限責任公司。

2 方法

2.1 前處理步驟

（1）將玉米樣品粉碎，稱取5.0 ± 0.05 g 粉碎后的樣品；（2）加入25 mL 60% 甲醇，劇烈振蕩 10 min；（3）4000 r/min，離心5 min；（4）取1 mL上清液，用4 mL樣品稀釋液進行稀釋，混勻；（5）待測。

2.2 ELISA操作步驟

（1）加樣：每孔依次加入樣品，酶標物工作液，與抗體工作液，各50 μL；（2）孵育：室溫孵育30 min；之后，用洗滌液洗滌五次。（3）顯色：每孔加入顯色液A與顯色液B各50 μL，室溫避光作用15 min。（4）每孔加入50 μL終止液，用酶標儀檢測其450 nm處的OD值[5]。

2.3 添加回收率計算

在玉米樣品中添加適當濃度的黃曲霉毒素B1，嘔吐毒素，或玉米赤霉烯酮，按照2.1的步驟進行前處理，之后按照2.2的步驟檢測，每個樣品檢測4次，計算添加回收率與平均值。添加回收率的計算方法：添加回收率 = （樣品檢測濃度 – 空白樣品檢測濃度）/ 添加濃度×100%。

3 結果

3.1 標準曲線

黃曲霉毒素B1的ELISA標準曲線見圖1。由圖1可知，黃曲霉毒素B1的IC50為0.14 ng/mL。

嘔吐毒素的ELISA標準曲線見圖2。由圖2可知，嘔吐毒素的IC50為20.4 ng/mL。

玉米赤霉烯酮的ELISA標準曲線見圖3。由圖3可知，玉米赤霉烯酮的IC50為0.583 ng/mL。

3.2 添加回收率

玉米中黃曲霉毒素B1，嘔吐毒素，或玉米赤霉烯酮的添加回收率見表1，由表1可知，在玉米中添加5 ng/g黃曲霉毒素B1，平均添加回收率為89.2%，添加500 ng/g嘔吐毒素，平均添加回收率為94.8%，添加25 ng/g玉米赤霉烯酮，平均回收率為83.6%，結果的準確性較好。

4 討論

本研究采用酶聯免疫分析法檢測黃曲霉毒素B1，嘔吐毒素，或玉米赤霉烯酮，平均添加回收率在80%到100%之間，準確性較好，可以滿足國家限量標準[4]。本研究為開發檢測真菌毒素的蛋白質芯片及方法奠定了基礎。

蛋白質芯片的技術原理是，將各種蛋白質有序地固定于芯片基底上，然后樣品中標記了特定探針的生物分子與芯片作用，目標分子與固定蛋白質通過抗原-抗體相互作用等原理結合，經過漂洗將未能與芯片上的蛋白質互補結合的成分洗去，再利用相應技術進行檢測[6]。蛋白質芯片在醫療診斷[7]，食品安全[8]，環境監測[9]等領域具有重要應用價值，有報道稱蛋白質芯片可以用于真菌毒素的檢測。李建林等人建立一種用光子晶體微球流式芯片檢測真菌毒素的方法，可以同時檢測黃曲霉毒素、伏馬毒素和桔青霉毒素[10]。王瑩等人建立了一種蛋白質芯片檢測方法，可以檢測黃曲霉毒素B1，黃曲霉毒素M1等六種真菌毒素[11]。王瑩等人還建立了一種懸浮芯片檢測方法，可以檢測嘔吐毒素，T2毒素等四種真菌毒素[12]。

本研究的下一步計劃是建立蛋白質芯片檢測真菌毒素的方法，在蛋白質芯片上包被多種真菌毒素的合成抗原，組成真菌毒素的檢測位點陣列，在芯片上加入待測物，抗體與熒光標記探針，通過免疫反應形成抗原-抗體-熒光探針復合物，使用熒光檢測器檢測信號。該方法與傳統的酶聯免疫分析方法相比，通量更高，而且可以同時檢測多種真菌毒素，可以極大的縮短檢測時間。

參考文獻：

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[8]Joon Myong Song，Tuan Vo-Dinh. Miniature biochip system for detection of Escherichia coliO157：H7 based on antibody-immobilized capillary reactors and enzyme-linked immunosorbent assay. Analytica Chimica Acta，507（1）： 115–121.

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[10]李建林，鄧國哲，徐坤等.一種用光子晶體微球流式芯片檢測真菌毒素的方法.中國， CN201210359576.8[P]， 2013-1-16.

[11] Wang T， Liu N， Gao Z X， et al. Simultaneous and rapid detection of six different mycotoxins using an immunochip. Biosens. Bioelettron， 2012， 34： 44-50.

[12]Y Wang， B Ning， Y Peng， et al. Application of suspension array for simultaneous detection of four different mycotoxins in corn and peanut.Biosensors & Bioelectronics，2013，41（8）：391–396.

第一作者及通訊作者簡介：王琳（1980-），男，碩士，研究方向為快速診斷檢測技術的研究開發和應用等。電子信箱：lin.wang@pgeneral.com.cn。