α—淀粉酶對類黃酮抗氧化活性的影響

陳磊　蘇煥斌　韓振亞　羅永潮　邱國棟

類黃酮的化學結構及其取代基的位置基本決定了它們的抗氧化效果。目前廣泛認為，B環是類黃酮抗氧化能力、清除自由基的重要活性部位，一般情況下，B環上羥基基團越多，其生物活性就越強。而羥基基團的糖苷化和2、3位雙鍵氫化都容易引起類黃酮生物活性的降低。

該文通過采用氧自由基清除能力（oxygen radicalabsorbance capacity，ORAC）評價法、DDPH自由基清除法、抗亞油酸氧化法、還原能力法四種不同的抗氧化活性評價方法，旨在測定類黃酮在加入PPA溶液前后，類黃酮抗氧化能力的變化情況。

材料與儀器

PPA購自于Sigma公司；類黃酮（木犀草素、香葉木素、柚皮素、二氫楊梅素、山奈酚、槲皮素）購自陜西慧科植物開發有限公司，純度達98%；熒光素鈉，維生素E水溶性類似物Trolox，2，2-偶氮二異丁基脒二鹽酸鹽（2，2-Azobis（2-methylp ropionamidine）dihyd rochIo ride，AAPH），1，1-二苯基-2-三硝基苯肼（1，1-Diphenyl-2-picrylhydrazyl radical 2，2-diphenyl-1-（2，4，6-trinitrophenyl）hydrazyl，DDPH），亞油酸均購自于Sigma公司，其余試劑均為國產分析純，所有溶液均用等離子水配制，并用0.2mol/L的磷酸鹽緩沖液（phosphatebuffer saline，PBS）以保持pH6.8±0.02的生理條件。

全波長掃描式多功能酶標儀，紫外可見分光光度計數顯，恒溫水浴鍋，pH值精度計，超聲細胞粉碎器，數控超聲波清洗器

試驗方法

PPA對類黃酮ORAC體系抗氧化能力的影響。稱取1mg類黃酮（木犀草素、香葉木素、柚皮素、二氫楊梅素、山奈酚、槲皮素）溶于2mL二甲基亞砜，得到0.5mg/mL的類黃酮儲備液。取10μL類黃酮儲備液與9901JLPPA液（溶于pH7.4的PBS緩沖液，0.328U/mL）、990mLpH7.4的PBS緩沖液，混勻于37℃反應30min，分別得到1mL兩組樣液并加以標記為樣液1和樣液2。同時，將類黃酮儲備液換成等體積的二甲基亞砜作同樣處理，作為對照以排除二甲基亞砜對整個試驗結果的影響。

在96微孔平板中依次加入20μL上述兩種樣液、對照液和五種不同濃度的Trolox標準溶液，板的邊緣孔均加入等體積的pH7.4的PBS緩沖液；然后每孔加入200pL的已配置好的熒光素鈉鹽溶液（現配現用），再運用Wallace1420Manager軟件設定測定程序，自動混勻，在37℃條件下預熱20min；待96孔平板出機后，迅速加入20μLAAPH（現配現用），自動混勻，儀器開始自動測定。在激發波長485nm，吸收波長535nm條件下，每隔2min記錄一次熒光強度值，每次紀錄前自動震蕩混勻8s，共測定60個循環，熒光強度分別記錄為f1，f2，f3，……，f60；利用相應軟件計算AUC值，再計算ORAC值。則PPA對類黃酮ORAC體系抗氧化能力的抑制率算術公式如下：

PPA對類黃酮清除DDPH自由基的影響。準確稱取20mgDDPH粉末，用無水乙醇溶解并定容至250mL，得到摩爾濃度為2×10^-4mol兒的DDPH乙醇混合液，現配現用。

將類黃酮（木犀草素、香葉木素、柚皮素、二氫楊梅素、山奈酚、槲皮素）溶于無水乙醇，得到20，40，60，80，100μg/mL不同濃度的類黃酮溶液。取50HL上述不同濃度的類黃酮溶液與0.2mLPPA液（溶于pH6.8的PBS緩沖液，0.328U/mL）混合并于37℃水浴30min，再加入3mL的2×10^-4mol/L的DDPH乙醇混合液，混勻后，在黑暗處室溫條件下靜置30min。用無水乙醇作為參比液，在517nm處測定樣品的吸光值。對照組為將PPA液換成等量的PBS緩沖液；空白組為將黃酮液換成等量的無水乙醇，平行測定三次。則通過擬合曲線可得類黃酮加入PPA溶解液前后的半抑制濃度UC50值，以及PPA對黃酮抗亞油酸氧化的抑制率的算術公式如下：

PPA對類黃酮抗亞油酸氧化的影響。稱取亞油酸0.6g，吐溫-20 0.5g溶于150mL pH 6.8 0.2mol兒的PBS緩沖液中，在超聲細胞粉碎器下工作20min，得到均一體系的混合液。

將0.2mL0.1mg/mL的黃酮液（溶于二甲基亞砜），不同酶活力的PPA液先混合37℃水浴30min，再加入上述混合液2.5mL，5mL20mMAAPH反應液混合均勻于反應器中恒溫水浴70min。

取出上述反應液0.1mL于具塞試管中，加入4.7mL乙醇（75%），0.1mL硫氰酸銨（30%）和0.1mLFeCl₂（20mM，溶于3.5%HCl中）混勻，在500nm處測得吸光度值A500（以75%乙醇作參比液）。對照組為將PPA液換成等量的PBS緩沖液；空白組為將黃酮液換成等量的二甲基亞砜液，平行測定三次。則PPA對黃酮抗亞油酸氧化的抑制率的算術公式如下：

PPA對類黃酮還原能力的影響。將0.05mg/mL100μL黃酮液（溶于二甲基亞砜）與不同酶活力的PPA液混合于37℃恒溫水浴鍋內水浴30min，依次加入2.5mL0.2mol/L的PBS緩沖液和2.5mL已配置好質量分數為1%的K₃Fe（CN）₆，再置于50℃水浴鍋內保溫20min后，快速冷卻，加入2.5mL質量分數10%三氯乙酸溶液，以3000r/min的轉速離心10min，取離心后的上清液2.5mL，依次加入4mL蒸餾水，1mL質量分數0.1%三氯化鐵溶液，充分混勻，靜置10min后，在700nm下測定其吸光度A700（以蒸餾水為參比液）。對照組為將PPA液換成等量的PBS緩沖液；空白組為將黃酮液換成等量的二甲基亞砜液，平行測定三次。則PPA對黃酮還原力的抑制率I的算術公式如下：

結果與分析

PPA對類黃酮ORAC體系抗氧化能力的影響。ORAC評價方法是依據氧自由基（AAPH）破壞熒光探針，促使熒光強度發生一定程度的變化，同時以維生素E水溶性類似物Trolox作為定量標準，采用多功能熒光微孔板掃描分析儀加以檢測分析。熒光強度的比那話大小反映了自由基破壞的程度。當抗氧化劑存在時，抗氧化劑可以抑制自由基破壞熒光探針，延緩其熒光強度的衰減速度，通過分析計算得出的ORAC值反映了抗氧化劑對自由基的抗氧化能力。

從圖1中可以看出，PPA對類黃酮ORAC抗氧化體系的抑制作用不太明顯，其中對木犀草素的抑制作用最大，其抑制率也只有19.88%，對槲皮素的抑制作用最小，其抑制率僅為3.56%。PPA對六種類黃酮ORAC抗氧化體系的抑制作用大小順序為木犀草素>香葉木素>柚皮素>二氫楊梅素>山奈酚>槲皮素。這種結果可能表明PPA與類黃酮相互作用的結合位點不在類黃酮清除自由基能力的活性部位（酚羥基），也間接說明了氫鍵對PPA和類黃酮發生相互結合作用的貢獻不大，但與兩者間的結合強度存在一定的聯系。

PPA對類黃酮清除DDPH自由基的影響。DDPH自由基溶于乙醇溶液后，在可見光范圍內517nm處有強吸收，呈深紫色，當加入自由基清除劑（抗氧化劑）后，其與DDPH自由基中的單電子配對從而使DDPH自由基在517nm處的強吸收逐漸消失，吸光值與DDPH自由基接受的電子數量呈一定的定量關系。

如表1所示，PPA對六種類黃酮清除DDPH自由基的能力均具有一定程度的抑制作用，但抑制作用程度不大。其中PPA對木犀草素清除DDPH自由基能力的抑制作用最大，也僅為18.91%。同時，測定類黃酮與PPA反應前后清除DDPH自由基活性的半數抑制濃度（IC50），結果顯示類黃酮與PPA反應后的IC50值明顯增加。PPA對類黃酮清除DDPH自由基活力的抑制作用強弱順序為：木犀草素>香葉木素>柚皮素>二氫楊梅素>山奈酚>槲皮素。此外，通過測定類黃酮清除DDPH自由基在加入PPA前后的半抑制濃度IC50值，其結果反映了這六種類黃酮清除DDPH自由基的能力強弱，同時也表現了PPA較小程度地削弱了類黃酮清除DDPH自由基的能力。

PPA對類黃酮抗亞油酸氧化的影響。圖2所示PPA對類黃酮抗亞油酸氧化能力的影響，隨著PPA濃度的增大，其對類黃酮抗亞油酸氧化的抑制作用就隨之增強。PPA（0.082U）對木犀草素抗亞油酸氧化的抑制作用最強，達到44.21%；PPA對槲皮素抗亞油酸氧化活性的抑制作用最弱，僅為17.56%。PPA對六種類黃酮抗亞油酸氧化的抑制作用強度大小順序為木犀草素>香葉木素>柚皮素>二氫楊梅素>山奈酚>槲皮素。這種結果表明，PPA與類黃酮發生相互結合作用后，在亞油酸乳化體系中，PPA的長分子鏈可能更緊密地包裹和纏繞類黃酮的活性基團，促使PPA與類黃酮的結合位點及強度發生變化，從而導致PPA對類黃酮抗亞油酸氧化的抑制作用增強，具體作用機理有待進一步研究。這也說明PPA與類黃酮相互作用的強弱程度，不僅與兩者的化學構造有關，亦與兩者混合后所形成的復合物所處的微環境息息相關。

PPA對類黃酮還原能力的影響。抗氧化劑（類黃酮）給出自身電子而具有還原作用，還原能力越強，抗氧化活性越強。試驗中的抗氧化劑可使鐵氰化鉀中的三價鐵還原成二價鐵，而還原生成的二價鐵（亞鐵氰化鉀）通過與三氯化鐵發生進一步反應生成普魯士藍，其在700nm處有一強吸收，其吸光值越大，還原能力就越強。

由圖3可知，隨著PPA濃度的增加，其對類黃酮還原能力的抑制作用也隨之增強，但增加幅度不大。PPA（0.082U）對木犀草素還原能力的抑制作用最大，為17.04%；PPA對槲皮素還原能力的抑制作用最小，僅為6.75%。PPA對六種類黃酮還原能力的抑制作用強度大小順序為木犀草素>香葉木素>柚皮素>二氫楊梅素>山奈酚>槲皮素。

結論

采用ORAC抗氧化體系評價法、DDPH自由基清除法、抗亞油酸氧化法、還原能力法這四種不同的抗氧化活性評價方法，評價了六種類黃酮在與PPA反應前后其抗氧化活性的變化情況。PPA對類黃酮ORAC抗氧化體系、清除DDPH自由基以及還原能力的抑制作用均不明顯，最大抑制率分別為19.88%、18.91%、17.04%但在脂質體系內，PPA對類黃酮抗亞油酸氧化的抑制作用程度較大，最大抑制率為44.21%。對于上述四種抗氧化活性評價方法，PPA對這六種類黃酮抗氧化活性的抑制作用強弱順序均為：木犀草素>香葉木素>柚皮素>二氫楊梅素>山奈酚>槲皮素。