水產(chǎn)品中硝基呋喃類代謝物殘留量高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜快速檢測法的研究

周道志

硝基呋喃類抗生素主要包括呋喃唑酮、呋喃它酮、呋喃西林、呋喃妥因，是一類廣譜抗生素，被廣泛用作飼料添加劑。研究表明，硝基呋哺類藥物是一種誘導(dǎo)有機(jī)體基因突變的有害物質(zhì)。近幾年來，我國、歐盟（EU）、韓國等在適用動物禁用的獸藥中已明令禁用硝基呋哺類藥物，檢測硝基呋喃類化合物的代謝產(chǎn)物對監(jiān)控禁藥更具有實際意義。

當(dāng)前國際上普遍采用液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法進(jìn)行硝基呋喃代謝物的檢測和確證。水解和衍生化是質(zhì)譜法檢測硝基呋喃代謝物的關(guān)鍵步驟，常用的衍生化試劑是鄰硝基苯甲醛，衍生時間長達(dá)16h，使硝基呋喃傳統(tǒng)的質(zhì)譜檢測方法最快檢測周期長達(dá)約19小時。本快速檢測方法與傳統(tǒng)方法相比，改變了酸性水解液的濃度、改變了樣品孵育的方式及溫度，將樣品的孵育溫度由37℃直接提高至60℃且使用水浴孵育提高樣品孵育的效率。在酸性條件下使硝基呋哺代謝物與蛋白質(zhì)水解，同時用鄰硝基苯甲醛衍生化，研究對比發(fā)現(xiàn)使用水浴60℃水浴孵育衍生0.5h時，不僅能夠大幅縮短反應(yīng)時間，而且可以達(dá)到傳統(tǒng)質(zhì)譜檢測方法的靈敏度，且方法的重現(xiàn)性好，精密度高，最快的檢測周期由傳統(tǒng)質(zhì)譜檢測方法的19小時縮短至3.5小時，實現(xiàn)了使用質(zhì)譜儀對水產(chǎn)品中硝基呋喃代謝物的快速檢測。

方法原理

樣品經(jīng)0.2MHCl提取，樣品中的AOZ、SEM、AHD、AMOZ殘留物與衍生化試劑2-硝基苯甲醛（NBA）反應(yīng)，分別生成NP-AOZ、NP-SEM、NP-AHD、NP-AMOZ，衍生物經(jīng)乙酸乙酯萃取，萃取液用氮氣流揮干，殘渣用純凈水溶解后用正己烷脫脂，用液相色譜一質(zhì)譜/質(zhì)譜儀測定，外標(biāo)法峰面積定量。

檢測流程

樣品制備（水產(chǎn)品取可食部分）——樣品恒溫孵育提?。ㄋ庖簼舛?.2M鹽酸、水浴、60℃）——樣品凈化——樣品測定。

具體檢測步驟

試樣制備。

蝦去殼取蝦肉，魚去皮去骨頭取肌肉，用組織粉碎機(jī)勻質(zhì)。裝入潔凈容器內(nèi)，密封，標(biāo)記，于-18℃保存，每份樣品量不少于100g。

分析步驟。

（1）提取步驟。稱取經(jīng)肉類組織粉碎機(jī)粉碎的試樣2g（精確至0.01g）于50mL離心管中，加入10mL0.2Mol/L鹽酸溶液在勻漿機(jī)上以16000r/min速度勻漿15秒，用5mL0.2Mol/L鹽酸溶液洗滌勻漿刀，合并提取液。

（2）樣品恒溫孵育提取。離心管中加入4001JL]00mMol/L新配制的2-硝基苯甲醛（NBA）衍生試劑振蕩]分鐘；放在60℃恒溫水浴鍋中反應(yīng)0.5小時。孵育過程要注意避光操作。

（3）凈化方法。離心管在4500r/min下離心10min，上清液轉(zhuǎn)入另一離心管中，殘渣棄去。上清液中加入5mL0.1Mol/LKH₂PO₄溶液，用1Mol/LKOH溶液調(diào)節(jié)pH值在7～7.5范圍。離心管中加入10mL乙酸乙酯，在振蕩器上震蕩5分鐘，以4500r/min速度離心10min，吸取5mL上層清液（相當(dāng)于1g樣品）移至吹氮濃縮儀的吹氮管中，在50℃下用氮氣將試管內(nèi)的溶劑揮干，殘渣用1mL純凈水溶解，漩渦振蕩器上混漩60秒，加入3mL正己烷，漩渦振蕩器上混漩60秒，在4500r/min下離心10min后，樣液經(jīng)0.22μm濾膜過濾后上機(jī)測定。

儀器參數(shù)與測定。

（1）色譜測定條件。色譜柱：菲羅門C₁₈，150mm×2.0mm（id），粒度5μm，luna；流動相：乙腈+0.1%甲酸水溶液，梯度洗脫模式。

（2）質(zhì)譜條件。離子源ESI，正模式，多反應(yīng)選擇離子監(jiān)測方式（MRM）。

結(jié)果與分析

樣品衍生條件的優(yōu)化。4種硝基呋喃的分子量在75～201，在這個質(zhì)量范圍內(nèi)質(zhì)譜背景噪音很大，4種代謝產(chǎn)物的電離效率比較低，因此它們的質(zhì)譜檢測靈敏度低。而在酸性條件下，利用鄰硝基苯甲醛上的醛基（-CHO）可以與AMOZ、SEM、AHD、AOZ等4種代謝物上的含氮親核基團(tuán)胺基（-NH）發(fā)生醛胺親核加成反應(yīng)，可以分別形成較好的特性衍生物，使衍生物的分子離子質(zhì)荷比大于200，處于相對適于檢測的質(zhì)量區(qū)域，質(zhì)譜檢測靈敏度會有很大提高。在實驗室多年的硝基呋喃類檢測的經(jīng)驗和參考相關(guān)資料的基礎(chǔ)上，選擇采用鹽酸水解，鄰硝基苯甲醛衍生化。本試驗比較了37℃恒溫（空氣?。┱袷嶿6h，60℃恒溫（空氣?。┱袷?h，60℃恒溫水浴2h，60℃恒溫（空氣?。┱袷?.5h，60℃恒溫水浴0.5h等5種條件下的衍生效率。研究發(fā)現(xiàn)，60℃恒溫水浴衍生效率比60℃恒溫（空氣?。┱袷幯苌矢?，60℃恒溫水浴2h與0.5h沒有顯著差異（見表]），均達(dá)到標(biāo)準(zhǔn)SN/T1627-2005的要求。本試驗60℃恒溫水浴0.5h，縮短了反應(yīng)時間且產(chǎn)率提高，實現(xiàn)了快速檢測。本試驗中還比較了pH值對衍生效率的影響，研究發(fā)現(xiàn)pH值為7.0-7.5時，4種呋喃代謝物衍生物的回收率最高。

快速水解衍生方法的實驗回收率及靈敏度。為了確定快速檢測方法中4種呋喃代謝物衍生化效率的高低，本實驗在空白蝦基體中添加4種硝基呋喃代謝物標(biāo)準(zhǔn)溶液，使其濃度水平均為1μg/kg，然后采用上述的5種方式進(jìn)行衍生化處理，每種方式做6組平行，其實驗回收率及靈敏度如下表：

5種衍生化方式處理硝基呋喃樣品的實驗回收率及靈敏度比較可看出，60℃恒溫水浴衍生效率比60℃恒溫（空氣?。┱袷幯苌矢撸?0℃恒溫水浴2h與0.5h沒有顯著差異，均達(dá)到傳統(tǒng)質(zhì)譜檢測方法的效果，即可達(dá)到37℃恒溫（空氣?。┱袷?6h衍生的效果。本快速檢測方法與傳統(tǒng)質(zhì)譜檢測方法同樣具有較高的靈敏度、較好的重現(xiàn)性。因此，新方法能夠滿足實驗檢測分析的要求。

快速檢測方法的準(zhǔn)確性。以傳統(tǒng)質(zhì)譜檢測方法、行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)SN/T1627-2005檢測獲得的3個陽性蝦樣品，樣品1AOZ殘留量為0.851μg/kg，樣品2AOZ殘留量為2.58μg/kg的，樣品3SEM殘留量為1.23μg/kg。分別按標(biāo)準(zhǔn)SN/T1627-2005及本快速檢測方法60℃恒溫水浴0.5h衍生反應(yīng)進(jìn)行實驗處理，每個樣品做雙平行，結(jié)果如下表：

經(jīng)表2比較，由行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)方法測定殘留量分別為AOZ0.85μg/kg的樣品1和AOZ2.58μg/kg的樣品2及SEM殘留量為1.23μg/kg的樣品3，與本快速檢測方法重復(fù)測定的定量結(jié)果較一致，顯示了快速檢測方法對硝基呋喃檢測有較好的重復(fù)性和定性可靠性。因此，可看出本快速衍生化方法是可行的，即本硝基呋喃快速檢測方法完全能滿足硝基呋喃類代謝物殘留檢測的要求。

通過實驗及研究表明，硝基呋喃類代謝物高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜快速檢測方法檢測水產(chǎn)品中的呋喃唑酮代謝物AOZ、呋喃它酮代謝物AMOZ、呋喃西林代謝物SEM、呋喃妥因代謝物AHD等硝基呋哺類代謝物可行。該方法的準(zhǔn)確度、回收率和精密度均較好，真正意義上填補(bǔ)了水產(chǎn)品硝基呋喃類代謝物質(zhì)譜快速檢測領(lǐng)域的空白。