LBH589/來(lái)那度胺調(diào)控多發(fā)性骨髓瘤細(xì)胞中IRF4并促進(jìn)凋亡反應(yīng)的研究

唐思詩(shī)，馬 丹，成冰清，余琨琳，王季石△，彭 焱

(1.貴州醫(yī)科大學(xué)，貴陽(yáng) 550004；2.貴州醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院血液科，貴陽(yáng) 550004；3.南華大學(xué)附屬懷化醫(yī)院血液科 418000;4.湖南省人民醫(yī)院腫瘤科，長(zhǎng)沙 410000)

多發(fā)性骨髓瘤(MM)是一種侵襲性強(qiáng)并且不可治愈的血液系統(tǒng)惡性腫瘤[1]。目前為止，來(lái)那度胺、硼替佐米等仍然是MM的首選藥物，然而，部分MM患者在治療后仍然復(fù)發(fā),對(duì)骨髓瘤細(xì)胞致病機(jī)制的深入研究顯示，干擾素調(diào)節(jié)因子4(IRF4)是骨髓瘤生長(zhǎng)中不可缺少的轉(zhuǎn)錄因子，在骨髓瘤細(xì)胞中表達(dá)失調(diào)，而且會(huì)在相應(yīng)的腫瘤細(xì)胞染色體上發(fā)生變異、擴(kuò)增和突變[2]。表明IRF4可以作為尋找治療MM的新的治療靶點(diǎn),而降低MM的耐藥復(fù)發(fā)性已經(jīng)成為MM的重要問(wèn)題。

LBH589是一種FDA批準(zhǔn)為治療MM的化療藥物，已經(jīng)用于臨床治療MM患者，它是一種廣譜的去乙酰化酶抑制劑[3],作用機(jī)制很多，目前尚不完全明確。而來(lái)那度胺是一種免疫調(diào)節(jié)劑，已經(jīng)用于MM的治療[4],但MM患者仍然會(huì)產(chǎn)生耐藥或者復(fù)發(fā)。目前組蛋白乙酰化酶抑制劑(HDACi)與其他化療藥物聯(lián)合治療是誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡的主要方法，并且可以有效減少腫瘤細(xì)胞的耐藥以及復(fù)發(fā)[5]。本研究主要分析LBH589單藥或者聯(lián)合來(lái)那度胺在MM中的作用機(jī)制以及相關(guān)靶點(diǎn)，為臨床治療MM患者提供新的治療方法。

1 材料與方法

1.1材料 人MM細(xì)胞株RPMI8226以及人MM耐來(lái)那度胺細(xì)胞株RPMI8226-R由貴州醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院造血干細(xì)胞移植中心實(shí)驗(yàn)室凍存。LBH589(帕比斯他)購(gòu)自美國(guó)Selleck公司,TRIzol、逆轉(zhuǎn)錄試劑盒均為美國(guó)Invitrogen公司產(chǎn)品，CCK8、二甲基亞砜(DMSO)為賽蘭博科技有限公司產(chǎn)品，RPMI-1640培養(yǎng)基、胎牛血清購(gòu)自杭州四季青公司，AnnexinV-FITC/PI試劑盒(凱基生物)、HO-1一抗及二抗購(gòu)自碧云天生物技術(shù)研究所，Bax一抗購(gòu)自上海晶天生物技術(shù)有限公司,PCR引物由上海捷瑞生物工程有限公司合成。

1.2方法

1.2.1細(xì)胞培養(yǎng) RPMI8226和RPMI8226-R使用含10%胎牛血清,100 U/mL青霉素及100 mg/L鏈霉素的RPMI-1640培養(yǎng)基37 ℃、5% CO2、100%飽和濕度CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)，細(xì)胞接種密度(4～5)×105個(gè)/mL，使用處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

1.2.2細(xì)胞增殖抑制檢測(cè) 臺(tái)盼藍(lán)檢測(cè)細(xì)胞活力，LBH589單獨(dú)或者聯(lián)合來(lái)那度胺處理RPMI8226細(xì)胞24 h，根據(jù)制造商的指導(dǎo)，將5×103個(gè)細(xì)胞在培養(yǎng)基中或不用處理的96孔板中孵育，然后向每個(gè)孔中加入20 μL的CCK8溶液。在37 ℃下孵育40 min后，使用分光光度計(jì)測(cè)量450 nm處的吸光度，作出細(xì)胞增殖抑制率的曲線。

1.2.3細(xì)胞凋亡率檢測(cè) 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的RPMI8226細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞密度2×105個(gè)/mL，接種于6孔板，每孔1 mL，同時(shí)設(shè)置空白對(duì)照組、LBH589組，用預(yù)冷的PBS洗滌細(xì)胞2次，加入195 μL AnnexinV-FITC結(jié)合液輕輕重懸細(xì)胞，加入5 μL膜聯(lián)蛋白V-FITC，輕輕混勻。室溫避光孵育10 min，1 000 r/min離心5 min，棄上清液，加入190 μL AnnexinV-FITC結(jié)合液輕輕重懸細(xì)胞。加入10 μL碘化丙啶染色液，輕輕混勻，冰浴避光放置，隨即進(jìn)行流式細(xì)胞儀檢測(cè)，每組平行實(shí)驗(yàn)3次。

1.2.4Western blot檢測(cè) 收集各組細(xì)胞，提取細(xì)胞總蛋白。每份樣本取 40 μg總蛋白，經(jīng)10%的十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)后轉(zhuǎn)移至醋酸纖維素膜上，經(jīng)封閉液封閉過(guò)夜后加鼠抗人β-actin一抗(1∶500)，兔抗人HO-1一抗(1∶1 000)，兔抗人IRF4一抗(1∶500)，兔抗人 c-Myc一抗(1∶500)，兔抗人Bcl-2一抗(1∶1 000),兔抗人Bcl-xl一抗(1∶1 000),兔抗人Bax一抗(1∶1 000),兔抗人c-PARP一抗(1∶1 000),兔抗人Bad一抗(1∶1 000)室溫?fù)u膜90 min后TBST洗膜，分別加入兔IgG二抗(1∶1 000)室溫孵育45 min，TBST洗膜后用ECL試劑染色后曝光，每個(gè)實(shí)驗(yàn)至少重復(fù)3次。

1.2.5Real-time PCR檢測(cè) 使用Trizol試劑(Invitrogen，美國(guó))從細(xì)胞株中提取總RNA。使用SYBR Green PCR Master Mix(北京天根生物)和PRISM 7500實(shí)時(shí)PCR系統(tǒng)(ABI，美國(guó))進(jìn)行qPCR。分析相對(duì)于β-actin基因轉(zhuǎn)錄物水平的基因表達(dá)水平。cDNA樣品與引物和SYBR Master Mix混合，總體積為20 μL。方案中使用的熱循環(huán)條件在94 ℃下1 min；隨后在94 ℃下持續(xù)10 s，在60 ℃下持續(xù)15 s進(jìn)行40個(gè)循環(huán)。

2 結(jié) 果

2.1LBH589與來(lái)那度胺單獨(dú)或者聯(lián)合作用于RPMI8226細(xì)胞后的增殖抑制率 LBH589與來(lái)那度胺分別作用于RPMI8226的增殖抑制率呈劑量依賴關(guān)系,LBH589在濃度為0.08 μmol/L時(shí)，來(lái)那度胺濃度為20 μmol/L時(shí)，作用濃度分別達(dá)到峰值。LBH589聯(lián)合來(lái)那度胺比單用LBH589或者來(lái)那度胺效果明顯，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見(jiàn)圖1。

*:P<0.05,**:P<0.01，與空白對(duì)照組比較

圖1 LBH589與來(lái)那度胺對(duì)RPMI8826增殖抑制率的影響

2.2LBH589和來(lái)那度胺單獨(dú)或者協(xié)同誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡 LBH589單獨(dú)或者協(xié)同誘導(dǎo)RPMI8226細(xì)胞凋亡呈劑量依賴關(guān)系，RPMI8226細(xì)胞凋亡率隨著LBH589濃度的增加而增加。LBH589 0.01、0.02 μmol/L時(shí)誘導(dǎo)RPMI8226細(xì)胞凋亡率分別為(11.6±7.42)%、(27.66±7.1)%，單獨(dú)使用來(lái)那度胺2.5 μmol/L時(shí)凋亡率為(12.8±6.94)%，聯(lián)合用藥后，各株細(xì)胞凋亡率大幅度增長(zhǎng)，在LBH589 0.01 μmol/L以及0.02 μmol/L，來(lái)那度胺為2.5 μmol/L

圖2 LBH589與來(lái)那度胺對(duì)RPMI8826細(xì)胞凋亡的影響

時(shí)凋亡率分別為(36.4±11.1)%、(68.37±14.4)%，說(shuō)明LBH589和來(lái)那度胺聯(lián)合應(yīng)用時(shí)，顯著協(xié)同誘導(dǎo)凋亡作用，組間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05),見(jiàn)圖2。

圖3 LBH589與來(lái)那度胺對(duì)RPMI8826細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白的影響

2.3LBH589單獨(dú)以及聯(lián)合來(lái)那度胺作用于RPMI8226細(xì)胞后對(duì)凋亡相關(guān)Bcl-2、Bcl-xl、bad、Bax、c-PARP蛋白表達(dá)水平的影響 凋亡相關(guān)蛋白水平在LBH589與來(lái)那度胺合用時(shí)表達(dá)最低，與空白對(duì)照組(未處理組)比較，在用LBH589或者來(lái)那度胺后，細(xì)胞抗凋亡蛋白均有所下降，凋亡蛋白有所增加,見(jiàn)圖3。

A：Western blot檢測(cè)不同細(xì)胞株中IRF4蛋白的表達(dá)，以及LBH589處理后IRF4、c-MYC等蛋白的表達(dá)，以β-actin為內(nèi)參；B：Realtime PCR檢測(cè)不同濃度LBH589處理后IRF、c-MYC在mRNA水平上的表達(dá)。C：不同濃度LBH589單獨(dú)或者聯(lián)合來(lái)那度胺處理RPMI8226細(xì)胞24 h后IRF4、c-MYC等蛋白的表達(dá),以β-actin為內(nèi)參，*：P<0.05，**：P<0.01，與空白對(duì)照組比較

圖4 LBH589作用于RPMI8226細(xì)胞后IRF4、c-MYC表達(dá)下降

A:使用Realtime PCR檢測(cè)RPMI8226細(xì)胞與RPMI8226-R細(xì)胞HO-1與IRF4等mRNA的表達(dá),以β-actin為內(nèi)參，CCK8檢測(cè)細(xì)胞的增殖抑制率；B：Western blot檢測(cè)調(diào)控HO-1后IRF4、c-MYC蛋白水平的表達(dá)，以β-actin為內(nèi)參；*：P<0.05，**：P<0.01，與對(duì)照組比較；C：CCK8檢測(cè)LBH589單獨(dú)或者聯(lián)合來(lái)那度胺24 h后細(xì)胞的增殖抑制率

圖5 HO-1及IRF4對(duì)LBH589作用于RPMI8226-R細(xì)胞的影響

2.4LBH589誘導(dǎo)RPMI8226細(xì)胞中IRF4、c-MYC轉(zhuǎn)錄因子的下降 Western blot檢測(cè)不同來(lái)源的血液惡性腫瘤中IRF4的蛋白水平，發(fā)現(xiàn)IRF4在骨髓瘤細(xì)胞株中表達(dá)最高。檢測(cè)相關(guān)轉(zhuǎn)錄基因IRF4、c-MYC等轉(zhuǎn)錄因子蛋白表達(dá)隨LBH589濃度增高而明顯減低,以β-actin為內(nèi)參,與空白對(duì)照組比較，IRF4各蛋白表達(dá)隨LBH589濃度增加而降低明顯，見(jiàn)圖4A。其作用濃度同Realtime PCR濃度一致，見(jiàn)圖4B。聯(lián)合使用藥物后，IRF4與c-MYC表達(dá)更加低,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05),見(jiàn)圖4C。

2.5檢測(cè)RPMI8226、RPMI8226-R中HO-1、IRF4的表達(dá)，此時(shí)LBH589產(chǎn)生的增殖抑制率作用比IRF4表達(dá)低的明顯減少(圖5A)。使用Hemin 提高HO-1的表達(dá)，ZNPP降低HO-1的表達(dá)，使用Realtime PCR檢測(cè)IRF4的表達(dá)，發(fā)現(xiàn)IRF4表達(dá)與HO-1下降的程度一致(圖5B),使用LBH589單獨(dú)或者聯(lián)合來(lái)那度胺處理RPMI8226以及RPMI8226-R后檢測(cè)發(fā)現(xiàn)RPMI8226-R的增殖抑制率率低于RPMI8226，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見(jiàn)圖5C。

3 討 論

本研究分別觀察了廣譜組蛋白去乙酰化酶抑制劑LBH589和來(lái)那度胺單獨(dú)或者協(xié)同作用于骨髓瘤細(xì)胞系RPMI8226導(dǎo)致的增殖抑制以及凋亡的作用，結(jié)果顯示LBH589與來(lái)那度胺協(xié)同抑制腫瘤細(xì)胞的增殖以及誘導(dǎo)凋亡的作用，但相應(yīng)機(jī)制并不清楚。LBH589作為一種廣譜的去乙酰化酶抑制劑，是FDA批準(zhǔn)為治療MM的化療藥物[3]。而來(lái)那度胺是一種免疫調(diào)節(jié)劑，已經(jīng)用于MM的治療[4],但MM患者仍然會(huì)產(chǎn)生耐藥或者復(fù)發(fā)。目前HDACi與其他化療藥物聯(lián)合治療是誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡的主要治療方法，并且可以有效減少腫瘤細(xì)胞的耐藥以及復(fù)發(fā)[5]。為此本課題組選擇使用LBH589與來(lái)那度胺聯(lián)合治療MM，并且探討其相應(yīng)的機(jī)制，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，Bcl-2隨著藥物的作用表達(dá)逐漸下降，且Bax出現(xiàn)出上升趨勢(shì)，在不同的效應(yīng)細(xì)胞中，Bcl-2、Bax等蛋白因子在HDACi和免疫調(diào)節(jié)劑誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡中的分子機(jī)制還有待進(jìn)一步的研究。

本實(shí)驗(yàn)中已經(jīng)探查出IRF4在骨髓瘤細(xì)胞中高表達(dá)，與之前的研究一致[6]，本研究也證實(shí)了IRF4在骨髓瘤中表達(dá)水平也高于其他的血液惡性腫瘤細(xì)胞，為進(jìn)一步評(píng)價(jià)LBH589與來(lái)那度胺聯(lián)合治療MM的相應(yīng)的機(jī)制，本研究選擇了人多發(fā)性骨髓瘤細(xì)胞株RPMI8226細(xì)胞，證實(shí)隨著LBH589與來(lái)那度胺單獨(dú)或者聯(lián)合作用時(shí)IRF4表達(dá)下降，c-MYC的表達(dá)不太明顯,提示IRF4涉及LBH589和來(lái)那度胺誘導(dǎo)骨髓瘤凋亡的分子機(jī)制。

IRF4又稱為多發(fā)性骨髓瘤癌基因1，僅表達(dá)于淋巴系統(tǒng)，并且參與了淋巴系統(tǒng)的發(fā)育[7],IRF4又是B細(xì)胞發(fā)育和功能的關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子[8]。IRF4基因在淋巴系、造血系統(tǒng)等腫瘤中常常發(fā)生變異，其表達(dá)水平可作為臨床相關(guān)腫瘤治療的預(yù)后標(biāo)志[5,9]，此外，IRF4調(diào)控區(qū)有著c-MYC結(jié)合位點(diǎn)，c-MYC屬于MYC家族，是一類表達(dá)較弱，但相對(duì)穩(wěn)定，影響范圍非常廣泛的轉(zhuǎn)錄因子，c-MYC調(diào)控區(qū)也存在著IRF4的結(jié)合位點(diǎn)[10]，為了更進(jìn)一步地證實(shí)IRF4參與了LBH589以及來(lái)那度胺介導(dǎo)的凋亡作用，本課題組加用了RPMI226-R細(xì)胞株，因?yàn)镽PMI8226細(xì)胞株中IRF4表達(dá)較RPMI8226-R高，由此來(lái)進(jìn)一步證實(shí)IRF4參與了LBH589以及來(lái)那度胺介導(dǎo)的細(xì)胞增殖作用，接下來(lái)，本課題組通過(guò)CCK8實(shí)驗(yàn)證實(shí)了高表達(dá)的IRF4的RPMI8226-R的確影響了LBH589單獨(dú)以及聯(lián)合來(lái)那度胺導(dǎo)致的細(xì)胞增殖作用。更近一步得出LBH589單獨(dú)或者聯(lián)合來(lái)那度胺作用引起的細(xì)胞凋亡與IRF4降低有關(guān)，IRF4是潛在骨髓瘤藥物的治療靶點(diǎn)。已有研究證實(shí)激活蛋白-1(AP-1)寡聚復(fù)合體增強(qiáng)HO-1啟動(dòng)子活性[11]。BODDICKER等[12]也已經(jīng)證明AP-1是IRF4的啟動(dòng)子，本課題組已經(jīng)證實(shí)HO-1在MM以及其他血液惡性腫瘤中高表達(dá),并且與凋亡、耐藥相關(guān)[13-14]。因此筆者考慮IRF4的高表達(dá)引起的凋亡減少是否也與HO-1存在相關(guān)性，HO-1與IRF4的相關(guān)性值得進(jìn)一步研究。本研究表明Hemin提高HO-1表達(dá)以及ZNPP降低HO-1的表達(dá)均可以影響MM中IRF4、c-MYC的表達(dá)水平，證實(shí)二者存在相關(guān)性。HO-1、IRF4、c-MYC三者相互之間復(fù)雜的調(diào)控環(huán)路以及在腫瘤細(xì)胞中表達(dá)的失調(diào)，考慮HO-1/IRF4/c-MYC軸可用于治療MM的靶點(diǎn)，有潛力應(yīng)用于今后MM的治療，其具體分子機(jī)制有待于進(jìn)一步深入研究。

綜上所述，LBH589可抑制RPMI8226細(xì)胞的增殖且誘導(dǎo)凋亡，聯(lián)合來(lái)那度胺后這種作用更明顯。使用LBH589與來(lái)那度胺治療后明顯降低了IRF4以及輕微下調(diào)其下游c-MYC,使得抗凋亡蛋白Bcl-2下降以及促凋亡蛋白Bax表達(dá)增加而促進(jìn)MM細(xì)胞的凋亡，HO-1是MM的一個(gè)治療靶點(diǎn)，當(dāng)增強(qiáng)或者沉默HO-1時(shí)，IRF4與c-MYC明顯與HO-1的表達(dá)一致,這些數(shù)據(jù)均可表明IRF4有潛力成為去乙酰化酶抑制劑的治療靶點(diǎn)，而HO-1/IRF4/c-MYC軸也有潛力用于治療MM。

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