馬鈴薯X病毒研究進展

陳虞超　聶峰杰　張麗　鞏檑　甘曉燕　石磊　宋玉霞

摘 要：從PVX的發生與分布、基因組結構與功能、檢測方法、防治技術和應用研究方面進行了綜述，同時對PVX的應用前景進行了展望，旨在為PVX的深入研究提供參考。

關鍵詞：馬鈴薯X病毒；分布與發生；基因結構與功能；檢測方法；防治技術

馬鈴薯X病毒（Potato virus X，PVX）又稱馬鈴薯潛隱病毒（Potato latent virus）或馬鈴薯輕花葉病毒（Potato mild mosaic virus），為馬鈴薯X病毒屬（Potexvirus）模式成員，是由一條正鏈RNA組成的線性病毒，RNA長約6.4 kbp，病毒粒子呈長桿狀，長×寬=515 nm×13 nm。自然條件下主要靠寄主植株不同部位、寄主植株之間接觸摩擦進行機械傳播。PVX單獨侵染時癥狀較輕，與馬鈴薯Y病毒（Potato virus Y，PVY）、煙草脈斑駁病毒（Tobacco vein mottling virus，TVMV）、煙草蝕紋病毒（Tobacco etch virus，TEV）等馬鈴薯Y病毒屬病毒復合侵染時癥狀加劇，造成嚴重經濟損失[1～3]。目前有關PVX的分布與發生、基因組結構和功能、檢測方法、防控技術以及生產應用等方面的研究均取得顯著進展。本文對上述研究進展進行了綜述，探討其中尚存在的問題，以期為深入開展PVX相關研究提供一定參考。

1 PVX的發生與分布

所有馬鈴薯（Solanum tuberosum）產區均存在PVX發生的現象，但不同栽培品種受PVX侵染情況存在較大差異，有些品種帶毒率較高。在田間，PVX侵染馬鈴薯植株，引起輕型花葉或者潛隱病征，若多年侵染則易引起重花葉或者植株矮化，造成10%～80%減產。PVX常與PVY復合侵染，使癥狀加劇[4～6]。PVX主要靠汁液接觸傳播，也可以由某些昆蟲如異黑蝗（Melanoplus differentialis）和綠叢螽斯（Tettigonia viridissima）的咀嚼式口器經機械作用傳播，菟絲子（Cuscuta campestris）和集合油壺菌（Synchytium endobiotcum）也能夠傳播該病毒，但實生種子不能傳毒[7]。PVX 寄主范圍較廣，可侵染16科240種植物，茄科植物是主要的寄主，其診斷寄主有白肋煙（White burley）及其他煙草（Nicotiana tabacum）品種。初侵染的葉片通常表現為壞死斑，之后發展為壞死斑駁、褪綠、花葉或脈褪綠。在曼陀羅（Datura stramonium）上繼斑駁之后產生褪綠環，脈褪綠或脈壞死。煙草栽培品種適于作繁殖寄主。千日紅（Gomphrena globosa）是較好的指示植物，除HB株系外都產生局部斑[8，9]。

對于PVX株系的分類還未有統一的標準，但Cockerham[10]的方法認可度較高，該方法根據PVX侵染攜帶不同抗病基因（Nx和Nb）的馬鈴薯植株所表現出的癥狀，將PVX株系分為4組，分別是X1、X2、X3和X4。X1組（如CS35株系）在含Nx、Nb基因的馬鈴薯上均能引起過敏反應（Hypersensitive resistance，HR）。X2組（如CP株系）只在含Nb基因的馬鈴薯上引起HR。X3組（如UK3、DX株系）只在含有Nx基因的馬鈴薯上引起HR。X4組（如DX4、CP4、HB株系）則能完全克服Nx、Nb抗性。許多研究表明，PVX的外殼蛋白（Coat protein，CP）基因在決定PVX與植物抗病基因互作方面起著重要作用。CP可作為激發子使馬鈴薯產生HR、ER（極端抗病性，extreme resistance，ER）反應，CP基因核苷酸序列的變化會導致寄主產生不同的癥狀類型。因此，PVX的CP基因序列分析也有助于對PVX的分類研究[11～16]。

2 PVX的基因組結構與功能

PVX基因組由一條單組分的正單鏈RNA分子組成，長度約6.4 kbp。RNA的5′-末端有m7GpppA帽子結構，3′-末端有1個poly（A）尾結構，共包含5個開放式閱讀框（Open reading frane，ORF）。ORF1編碼166 kDa的RNA依賴的RNA聚合酶（RNA-dependent RNA polymerase，RdRp），是PVX合成RNA必需的，也是唯一來源于自身的蛋白。中間的ORF2、ORF3、ORF4相互重疊，被稱為三基因區段（Triple-gene block，TGB），分別編碼25 kDa的TGBp1蛋白、12 kDa的TGBp2蛋白、8 kDa的TGBp3蛋白，這些蛋白與病毒在寄主細胞間的移動有關，其中，TGBp1蛋白已經被證明是一種轉錄后基因沉默的抑制因子，可打破寄主植物的防御反應，使病毒成功侵染。3′-末端的ORF5編碼25 kDa的病毒外殼蛋白（Capsid protein，CP），除具有包裝核酸的功能外，也是病毒在細胞間移動所必需的，而且還能起到復制調節的作用[17～19]。

另外，PVX基因組還包括5′-末端非翻譯區域（5′-Untranslational region，5′-UTR）和3′-端非翻譯區域（3′-Untranslational region，3′-UTR）。5′-UTR有84個核苷酸（nt），已有的研究表明，5′-UTR對于病毒的復制、細胞與細胞間的移動以及病毒的組裝等有重要作用[20～23]。3′-UTR有72個核苷酸，含有多種重疊的作用元件，其中包括1個富含U的八核苷酸序列，對于病毒RNA與寄主蛋白之間的互作以及病毒的增殖起著重要作用[24]。

3 PVX的檢測方法

PVX的檢測方法較多，主要包括指示植物檢測法、電鏡檢測法、免疫學檢測法和核酸介導的分子生物學檢測法。

3.1 指示植物檢測法

指示植物檢測法是利用指示植物被PVX侵染后所表現出的特異癥狀，來檢測PVX是否存在。指示植物檢測法簡便可行，對儀器設備要求較低，可迅速掌握利用。吳凌娟等[9]用多種指示植物分離鑒定了PVX，結果發現千日紅發病時間短、易觀察，比較適合作為PVX檢測的指示植物。常用于檢測PVX的指示植物還包括白花刺果曼陀羅（Datura metel）、心葉煙（Nicotiana glutinosa）等。但指示植物檢測法耗時較長，受環境影響較大，準確性和靈敏度不高，已不作為PVX檢測和鑒定的主要方法，多用于分子生物學或免疫學檢測之前的初步鑒定[25]。

3.2 電鏡檢測法

電鏡檢測法是開展植物病毒研究的常規手段之一，主要是通過觀察病毒粒子形態、內含物、亞結構等方面的特征來確定病毒的種類。電鏡的分辨率可達到0.5 nm，比指示植物法更直觀、速度更快、觀察結果也更準確。張仲凱等[26，27]利用電鏡對云南地區的PVX等病毒進行了觀察和鑒定。電鏡還可以觀測到病毒引起的寄主細胞的病變和內含體特征，是深度研究病毒病機理的重要手段。但是，電鏡檢測法所需儀器設備昂貴，操作過程繁瑣，對人員要求較高，在PVX檢測上應用較少。

3.3 免疫學檢測法

①酶聯免疫吸附法 酶聯免疫吸附法（Enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA）由Voller等[28]首次應用于植物病毒檢測，主要是利用抗原與酶標抗體特異性結合以及底物的顯色反應，檢測病毒存在與否，并可對病毒含量進行初步測定。ELISA具有簡便、快速、準確、靈敏度高等優點，適合于口岸、生產企業開展大樣本檢測。ELISA依據支持物的不同可分為雙抗體夾心法（DAS-ELISA）和硝酸纖維素膜法（NCM-ELISA）。DAS-ELISA和NCM-ELISA在PVX檢測上應用較為廣泛。李云海等[29]利用ELISA對云南省馬鈴薯脫毒試管苗的PVX病毒進行了檢測；白艷菊等[30]利用DAS-ELISA對黑龍江省主栽馬鈴薯品種的脫毒試管苗及田間收獲薯塊感染PVX的情況進行了檢測；仲乃琴[31]利用DAS-ELISA對甘肅省種植的6個馬鈴薯品種的老齡薯、幼齡薯以及2個品種的莖尖組培苗攜帶PVX的情況進行了檢測分析；張國柱[32]利用NCM-ELISA對山西省的主栽馬鈴薯品種PVX感染情況進行了檢測，并均取得了較好的結果。

②免疫膠體金技術 免疫膠體金技術（Immune colloidal gold technique，ICG）是一種新型檢測技術，該技術操作簡單，樣品用量較少、無需特殊處理，檢測時間短，僅15 min便可完成，肉眼水平便可觀察結果，特別適合口岸檢疫、基層單位的實驗室和大田病毒病害的快速檢測[33，34]。魏梅生等[35]已研制出用于PVX檢測的ICG試紙條，該試紙條的靈敏度和精確度均較高。張麗等[36]利用ICG技術對寧夏地區不同馬鈴薯品種及不同級別脫毒種薯的脫毒情況進行了檢測，發現ICG檢測效果與ELISA相當，但具有樣本用量極小、操作簡單等優點，適用于一級種薯田間小樣本抽樣檢測。

3.4 分子生物學檢測法

分子生物學方法在馬鈴薯病毒檢測中的應用發展十分迅速。與傳統馬鈴薯病毒檢測方法相比，其具有靈敏度高、特異性好等優點，尤其是反轉錄-聚合酶鏈式反應（Reverse transcription polymerase chain reaction，RT-PCR）和核酸斑點雜交（Nucleic acid spot hybridization，NASH）技術已經被廣泛應用于PVX的檢測。

①RT-PCR技術 RT-PCR技術以PVX的RNA為模板，通過反轉錄合成cDNA，然后對cDNA擴增，最后進行檢測分析，該方法具有操作簡單、靈敏度高、快速、特異性強、重復性好和取樣量少等優點，十分適合種薯生產企業的質控管理[37]。關翠萍

等[38]運用一步RT-PCR法對馬鈴薯中的PVX等病毒進行了檢測，建立了靈敏度較高的一步法RT-PCR檢測技術。朱云芬等[2]建立了PVX的RT-PCR和

IC-RT-PCR（Immunocapture reverse transcription polymerase chain reaction）技術，認為這2種方法均具有較高的靈敏度，均可滿足檢測需求。在RT-PCR技術的基礎上，研究者們進一步開發了多重RT-PCR技術，可對PVX等多種馬鈴薯病毒同時進行有效的檢測[39～41]。

②NASH技術 NASH技術是將PVX基因組的一段核苷酸序列進行放射性或非放射性標記，制成探針，再與待檢樣品的核酸進行雜交，從而指示PVX的存在與否[42]。Eweida等[43]利用NASH檢測PVX，結果表明該方法的靈敏度是ELISA的100～250倍。Katarzyna等[44]利用NASH對馬鈴薯組培苗中的PVX等病毒進行了多重檢測。吳興泉等[45]首次在國內研究建立了PVX的NASH檢測技術，認為NASH可完全滿足檢測的實際要求。

4 PVX的防治技術

PVX的防治技術主要包括生產脫毒種薯、培育抗病毒品種和利用抗病毒化學藥劑3個方面。生產脫毒種薯是目前最主要的防控措施，培育抗病品種是今后的發展方向，研發有效的抗病毒化學藥劑也是一個重點領域。

4.1 脫毒種薯生產

脫除PVX的常用方法有熱處理脫毒法、莖尖培養脫毒法、熱處理結合莖尖培養脫毒法，其中熱處理結合莖尖培養脫毒法應用最為廣泛，脫毒效果也最顯著[46，47]。PVX脫毒種薯的生產流程主要分為4步，第一步是在實驗室利用上述脫毒方法去除PVX，得到馬鈴薯組培脫毒試管苗；第二步是在溫室或者網室內開展微型薯（也稱作原原種，薯塊質量1～20 g）的生產；第三步是在田間開展原種（薯塊質量小于

75 g）的生產；第四步是在田間開展一級種（也稱作生產種，薯塊質量50～100 g）的生產。在脫毒種薯的生產過程中，必須對各級種薯攜帶PVX的情況進行檢測，嚴格控制種薯帶毒率。

4.2 抗病品種培育

常規育種技術是馬鈴薯抗病毒病育種的主要途徑之一，主要是通過雜交等方法，將抗性栽培種、野生種或近緣種的抗病基因引入到主栽品種

中[48，49]。目前，研究者們已經分離了多個抗PVX的基因。Ritter等[50]分離定位了PVX的極端抗性基因Rx1和Rx2，并將其引入到馬鈴薯育種材料中；Bendahmane等[51]在馬鈴薯栽培種Cara中分離了

PVX的極端抗性基因Rx，并將其定位于Ⅻ染色體上；Tommiska等[52]從二倍體栽培種Solanum phureja IvP35中分離到PVX高敏抗性基因Nxphu，并將其定位到Ⅸ染色體上。

植物轉基因技術是馬鈴薯抗病毒病育種的一個新途徑，主要是通過轉基因手段，將具有抗PVX功能的外源基因整合到目標馬鈴薯品種的基因組中，增強其PVX抗性。這些功能基因種類較多，主要包括馬鈴薯自身的抗性基因、PVX外殼蛋白基因以及其他物種體內的抗性基因。張鶴齡等[53]、Doreste等[54]分別將PVX的CP基因轉入馬鈴薯品種虎頭、克新4號和cv. Desiree中，得到了具有較強PVX抗性的轉基因株系。Lodge等[55]將美國商陸（Phytolacca americana）的PAP基因轉入馬鈴薯品種Russet Burbank中，得到的轉基因后代表現出較強的PVX抗性。

4.3 抗病毒病化學藥劑的利用

利用化學藥劑對PVX進行防治也是一個重點研究方向。研究表明，嘌呤、嘧啶堿基類似物等物質具有抑制PVX活性的功能。Huber等[56]研究發現，8-氮雜鳥嘌呤、8-氮雜腺嘌呤和6-丙基-2-硫代尿嘧啶對PVX具有明顯的抑制作用；Schulze等[57]研究發現，6-氨基尿嘧啶、6-氨基胸腺嘧啶和9-（2，3-二羥基丙基）腺嘌呤具有抑制PVX復制的功能；Schuster等[58，59]發現，咪唑衍生物類物質病毒唑（三氮唑核苷）可完全抑制馬鈴薯莖培養物中PVX 的增殖，三嗪類衍生物DHT（2，4-二酮-六氫化1，3，5-三嗪）等對PVX也具有抑制作用。

5 PVX的應用

PVX主要用作植物外源基因的表達載體，研究者們多采用基因插入和融合蛋白2種構建方法構建PVX表達載體。基因插入法是將外源基因插入PVX的CP基因的2個重復啟動子之間，利用CP基因的啟動子來指導外源基因的表達。為了避免重復的啟動子同源結合導致外源基因丟失現象的發生，通常利用內部核糖體進入位點（1RES）取代其中1個啟動子[60]。融合蛋白是將目的基因以及通讀序列插入CP基因之前，編碼CP與目的基因的融合蛋白，然后利用病毒復制組裝將目的蛋白呈現在病毒粒子表面，表達后再從植物中分離出重組病毒，用蛋白酶消化后進行提純，得到抗原或非抗原藥物蛋白[60～62]。PVX作為表達載體具有易轉化、效率高等優點，在基礎研究和生產上都得到了廣泛的應用。Baulcombe等[63]、Avesani等[64]、Wagner等[65]、Zhou等[66]、楊鳳萍等[67]先后利用PVX載體生產了綠色熒光蛋白GFP、胰島素谷氨酸脫羧酶自抗原GAD65、植物過敏原、人巨粒細胞集落刺激因子GM-CSF和乙肝表面抗原HBsAg。PVX載體在商業上存在顯著的應用價值，Fitchen等[68]利用PVX載體在煙草中生產兒童病毒性胃腸炎疫苗VP6蛋白，該方法生產的疫苗具有安全性高、數量大、成本低、儲藏方便等優點。

6 展望

PVX病毒病是影響馬鈴薯生產的主要病害之一，對PVX開展深入研究具有重要的現實意義。目前有關PVX發生與分布、基因結構與功能、檢測方法等方面的研究較多，也取得了較大的進展。PVX病毒病防治方面，主要采用莖尖脫毒以及三級快繁體系生產脫毒種薯，抗病毒病化學藥劑因其防治效果有限，應用比較少。抗病毒病品種育種是PVX病毒病防治的主要發展方向，但這方面的研究進展較為緩慢，亟待加大研究力度，培育出既具有良好抗病性，又能滿足生產實際需求的馬鈴薯品種。雖然PVX易對馬鈴薯生產造成較嚴重的影響，但我們可以充分利用PVX的生物學特性，根據實際需求，將其改造成攜帶外源基因的表達載體，生產所需蛋白，有關這方面的研究將極具應用前景。

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