阿司匹林對宮頸癌裸鼠移植瘤組織中Bax及VEGF表達(dá)的影響

饒　燕, 王沛靚

(1. 解放軍海軍安慶醫(yī)院 婦產(chǎn)科, 安徽 安慶, 246003;

2. 新疆醫(yī)科大學(xué)第五附屬醫(yī)院 婦產(chǎn)科, 新疆 烏魯木齊, 830011)

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阿司匹林對宮頸癌裸鼠移植瘤組織中Bax及VEGF表達(dá)的影響

饒燕1, 王沛靚2

(1. 解放軍海軍安慶醫(yī)院 婦產(chǎn)科, 安徽 安慶, 246003;

2. 新疆醫(yī)科大學(xué)第五附屬醫(yī)院 婦產(chǎn)科, 新疆 烏魯木齊, 830011)

摘要:目的探討阿司匹林對宮頸癌裸鼠移植瘤組織中Bax及血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)表達(dá)的影響。方法健康雌性裸鼠40只，背部皮下接種HeLa細(xì)胞后隨機分為4組，各10只。阿司匹林組給予阿司匹林50 mg/(kg·d); 順鉑組給予順鉑15 mg/kg; 聯(lián)合用藥組同時給予阿司匹林和順鉑；對照組給予同等劑量的乙醇和生理鹽水。觀察各組移植瘤生長情況，計算抑瘤率；免疫組化法檢測各組Bax及VEGF表達(dá)量。結(jié)果與對照組相比，其余3組腫瘤體積、腫瘤質(zhì)量顯著降低(P<0.05或P<0.01)，阿司匹林組、順鉑組、聯(lián)合用藥組抑瘤率分別為43.10%、57.24%、82.49%; 與對照組相比，其余3組Bax蛋白表達(dá)明顯上調(diào)，聯(lián)合用藥組對Bax表達(dá)上調(diào)作用最強，其次為阿司匹林組；與對照組相比，其余3組VEGF蛋白表達(dá)明顯下調(diào)，聯(lián)合用藥組對VEGF蛋白表達(dá)下調(diào)作用最強，其次為阿司匹林組，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)。結(jié)論阿司匹林可能通過調(diào)節(jié)Bax及VEGF蛋白表達(dá)，與順鉑協(xié)同作用，達(dá)到抗腫瘤效果。

關(guān)鍵詞:宮頸癌; 阿司匹林; Bax; VEGF; 順鉑

阿司匹林是非甾體抗炎藥，能夠抑制環(huán)氧化酶活性，從而抑制前列腺素的合成，可用于鎮(zhèn)痛、解熱、抗炎[1]。近年來有研究[2-3]顯示，阿司匹林對移植性腫瘤、體內(nèi)致癌物誘發(fā)性腫瘤有抑制作用。多項實驗結(jié)果及臨床研究也表明，阿司匹林能夠?qū)苟喾N消化道腫瘤，且有化療增敏作用[4-6]。目前，阿司匹林在國外已被列為腫瘤化學(xué)預(yù)防劑。宮頸癌是女性最常見的惡性腫瘤之一，早期宮頸病變的治療效果遠(yuǎn)比宮頸癌的治療效果好。本研究通過了解阿司匹林對宮頸癌裸鼠移植瘤生長的影響，從促凋亡及抗血管生成角度探討了阿司匹林預(yù)防及治療宮頸癌的機制，報告如下。

1材料與方法

1.1實驗動物及主要試劑

健康雌性裸鼠40只, 6～8周齡，體質(zhì)量16～18 g, 購自四川大學(xué)實驗動物中心；宮頸癌HeLa細(xì)胞系購自賽齊(上海)生物工程有限公司；阿司匹林為拜耳醫(yī)藥保健有限公司生產(chǎn)；順鉑為南京制藥廠有限公司生產(chǎn); Bax鼠抗人單克隆抗體購自Santa Cruze公司(美國)；血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)羊抗人多克隆抗體購自R&D公司(美國)；其余試劑均為市售分析純。

1.2方法

1.2.1移植瘤模型建立及給藥：將37 ℃復(fù)蘇的HeLa瘤液以生理鹽水稀釋至活體瘤細(xì)胞數(shù)107個/mL, 取細(xì)胞懸液0.2 mL接種于裸鼠背部皮下，接種后隨機分為4組，每組10只。阿司匹林組給予阿司匹林50 mg/(kg·d), 無水乙醇溶解、生理鹽水稀釋后灌胃給藥，連續(xù)給藥14 d; 順鉑組腹腔注射順鉑注射液2.5 mL(含順鉑15 mg/kg), 單次給藥；聯(lián)合用藥組同時給予阿司匹林和順鉑，給藥方式同阿司匹林組及順鉑組；對照組給予同等劑量的乙醇和生理鹽水。

1.2.2各組抑瘤率測定：給藥后18 d處死裸鼠，剝離腫瘤，稱重，計算腫瘤體積及抑瘤率。腫瘤體積=長徑×1/2短徑2，抑瘤率=(1-各給藥組平均瘤質(zhì)量/對照組平均瘤質(zhì)量)×100%。

1.2.3Bax及VEGF的表達(dá)：將剝離的腫瘤組織以甲醛固定，石蠟包埋，4 μm切片，常規(guī)脫蠟，梯度酒精脫水, 30%過氧化氫封閉，pH 6.0檸檬酸鹽緩沖液修復(fù)抗原。滴加一抗，4 ℃冰箱孵育過夜, 37 ℃孵育2 h, 加入聚合物增強劑50 μL, 室溫孵育20 min, 滴加辣根過氧化物酶標(biāo)記的二抗，室溫孵育30 min，DBA顯色，蘇木素復(fù)染，中性樹膠封片。以PBS代替一抗做陰性對照，已知Bax及VEGF陽性切片做陽性對照。

1.3評價標(biāo)準(zhǔn)

Bax及VEGF陽性表達(dá)判定：根據(jù)細(xì)胞著色深度，基本無染色為0分；可見明顯高于背景的淡黃色顆粒為1分；可見較多棕黃色顆粒為2分；可見大量深棕黃色顆粒為3分。隨機選擇5個視野，計數(shù)500個細(xì)胞，計算陽性細(xì)胞所占百分比，若陽性細(xì)胞數(shù)為0%記0分; 1～33%記1分; 34%～66%記2分；≥67%記3分。將得分相加，總分0～1分為陰性(-); 2～3分為弱陽性(+); 4～6分為中等陽性(2+)；7～9分為強陽性(3+)。

2結(jié)果

2.1各組裸鼠移植瘤生長情況比較

與對照組相比，其余3組腫瘤生長減慢，腫瘤體積及腫瘤質(zhì)量顯著降低(P<0.01); 其中聯(lián)合用藥組生長最慢，與其他3組比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)。見表1。

表1　各組裸鼠移植瘤生長情況±s)

與對照組比較, **P<0.01; 與順鉑組比較, ##P<0.01; 與阿司匹林組比較, △△P<0.01。

2.2各組移植瘤中Bax的表達(dá)情況

Bax主要表達(dá)于細(xì)胞質(zhì)，少量表達(dá)于細(xì)胞膜上，陽性表達(dá)呈淡黃色至深棕黃色顆粒。與對照組相比，其余3組Bax蛋白表達(dá)明顯上調(diào)，聯(lián)合用藥組對Bax表達(dá)上調(diào)作用最強，其次為阿司匹林組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)。見表2。

2.3各組移植瘤中VEGF的表達(dá)情況

VEGF蛋白表達(dá)于胞質(zhì)，陽性表達(dá)呈棕黃色顆粒。與對照組相比，其余3組VEGF蛋白表達(dá)明顯下調(diào)，聯(lián)合用藥組對VEGF蛋白表達(dá)下調(diào)作用最強，其次為阿司匹林組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)。見表3。

表2　各組移植瘤中Bax的表達(dá)[n(%)]

表3　各組移植瘤中VEGF的表達(dá)[n(%)]

3討論

細(xì)胞凋亡是為維持內(nèi)環(huán)境穩(wěn)態(tài)，由基因控制的細(xì)胞自主有序的死亡。細(xì)胞凋亡涉及一系列基因的激活、表達(dá)以及調(diào)控，在腫瘤的發(fā)生、發(fā)展和防治中有重要意義。Bax是凋亡抑制基因bcl-2家族成員之一，其主要作用是促進(jìn)細(xì)胞凋亡。細(xì)胞凋亡發(fā)生與否受到體內(nèi)Bax與bcl-2的調(diào)節(jié)，當(dāng)Bax增加時，細(xì)胞易被誘導(dǎo)發(fā)生凋亡，而當(dāng)bcl-2增加時，細(xì)胞凋亡則受到抑制[7]。多項研究[8-10]表明，阿司匹林能夠通過上調(diào)Bax的表達(dá)，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，抑制宮頸癌、骨髓瘤、卵巢癌等腫瘤細(xì)胞的生長。本研究通過建立裸鼠移植瘤模型，其免疫組化結(jié)果顯示，阿司匹林能夠上調(diào)移植瘤組織中Bax蛋白的表達(dá)，聯(lián)合用藥組上調(diào)最為明顯，提示阿司匹林可能與順鉑具有協(xié)同抗腫瘤作用，通過上調(diào)Bax表達(dá)起到化療增敏效應(yīng)。

腫瘤新生血管形成是實體瘤生長、浸潤、轉(zhuǎn)移的基礎(chǔ)，而VEGF能夠促進(jìn)血管內(nèi)皮細(xì)胞增殖，是腫瘤血管生成的重要調(diào)節(jié)因子[11-12]。研究[13-15]表明, VEGF在骨肉瘤、非小細(xì)胞肺癌、肝癌等多種腫瘤中高表達(dá)，對腫瘤的發(fā)生、發(fā)展有重要作用。本研究觀察了不同藥物作用下，裸鼠移植瘤中VEGF的表達(dá)，結(jié)果顯示，VEGF的陽性表達(dá)率在對照組、順鉑組、阿司匹林組、聯(lián)合用藥組中逐漸降低，阿司匹林對VEGF蛋白表達(dá)有顯著抑制作用，而與順鉑聯(lián)用后，抑制作用更強，提示，阿司匹林可通過抑制VEGF的表達(dá)影響腫瘤血管的生成，從而抑制腫瘤的生長、侵襲、轉(zhuǎn)移。

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Effect of aspirin on the expressions of Bax and VEGF in human cervical cancer xenografts in nude mice

RAO Yan1, WANG Peiliang2

(1.DepartmentofGynecologyandObstetrics,TheNavyAnqingHospitalofPeople′sLiberationArmy,Anqing,Anhui, 246003; 2.DepartmentofGynecologyandObstetrics,TheFifthAffiliated

HospitalofXinjiangMedicalUniversity,Urumqi,Xinjiang, 830011)

ABSTRACT:ObjectiveTo investigate the effect of aspirin on the expressions of Bax and vascular endothelial growth factor (VEGF) in human cervical cancer xenografts in nude mice. MethodsAfter subcutaneous injection of Hela cells, 40 healthy nude mice were randomly divided into aspirin group (n=10), cisplatin (DDP) group (n=10), combined drug group (n=10) and control group (n=10), and these groups were treated with aspirin 50 mg/(kg·d), DDP 15 mg/kg, aspirin plus DDP, equivalent dose of ethanol and physiological saline respectively. The tumor growth and weight were observed and the inhibition rate of tumor was calculated. The expressions of Bax and VEGF were detected by immunohistochemistry. ResultsThe tumor volume and weight were significantly lower in the aspirin group, the DDP group, the combined drug group than those in the control group (P<0.05 or P <0.01). The inhibition rate of tumor was 43.10% in the aspirin group, 57.24% in the DDP group and 82.49% in the combined drug group. The Bax protein was mostly up-regulated in the combined drug group than that in the aspirin group or the DDP group (P<0.01), and the VEGF was mostly down-regulated in combined drug group than that in the aspirin group or the DDP group (P<0.01). ConclusionAspirin combined with DDP may play synergistically anti-neoplastic effect by regulating the expression of Bax and VEGF.

KEYWORDS:cervical cancer; aspirin; Bax; vascular endothelial growth factor; cisplatin

中圖分類號:R 737.33

文獻(xiàn)標(biāo)志碼:A

文章編號:1672-2353(2016)07-015-03

DOI:10.7619/jcmp.201607004

基金項目:中國高校醫(yī)學(xué)期刊臨床專項資金(11524381)

收稿日期:2015-12-05