葉酸與八聚精氨酸雙修飾脂質體的制備及其功效觀察

金亞香，沈玉杰，趙毅，房學東(吉林大學中日聯誼醫院，長春 30033； 長春職業技術學院)

?

葉酸與八聚精氨酸雙修飾脂質體的制備及其功效觀察

金亞香1，沈玉杰1，趙毅2，房學東1(1吉林大學中日聯誼醫院，長春 130033；2 長春職業技術學院)

摘要：目的制備葉酸與穿膜肽八聚精氨酸(R8)雙修飾的脂質體，并觀察其功效。方法采用注入法制備葉酸與穿膜肽R8雙修飾的脂質體(FA-R8-LPs)，采用激光粒度分析儀對脂質體粒徑和電位進行測定，采用瓊脂糖凝膠電泳方法考察脂質體與VEGF siRNA的結合度，分別采用流式細胞計數法、激光共聚焦顯微鏡觀察及Western blotting法觀察載有VEGF siRNA脂質體對口腔癌KB細胞的抗腫瘤效果。結果葉酸與穿膜肽R8雙修飾的脂質體粒徑為(112.5±3.7)nm，電位為(3.23±0.88)mV。FA-R8-LPs已基本完全與VEGF siRNA結合(FA-R8-LPs-siRNA)。FA-R8-LPs-siRNA對KB細胞的抑制率為44.5%，平均熒光強度值是未修飾脂質體的5倍左右。FA-R8-LPs與未修飾的脂質體相比明顯提高了轉染效率。結論成功制備了葉酸與穿膜肽R8雙修飾的脂質體，該脂質體能增強VEGF siRNA的抗腫瘤效果。

關鍵詞：葉酸；穿膜肽；八聚精氨酸；脂質體

目前，核酸類藥物是治療惡性腫瘤的有效手段，但其具有容易被核酸酶降解、與細胞膜相互排斥、跨膜能力弱等特點[1～3]，高效率、低成本、低毒的藥物載體是解決以上問題的關鍵。細胞穿膜肽又稱蛋白轉導域，具有攜帶比自身大100倍的物質穿透細胞膜進入細胞的能力。八聚精氨酸(R8)是由8個精氨酸組成的穿膜肽，能夠穿過與之相接觸的任何細胞的細胞膜，具有高效的穿膜作用，能夠應用于核酸藥物的傳遞過程[4,5]。葉酸是一種水溶性維生素，能特異性結合葉酸受體，是公認的對于腫瘤細胞具有靶向性的配體[6～8]，將葉酸與R8兩種配體結合，制備雙修飾的脂質體，裝載核酸類藥物，以增強核酸類藥物的抗腫瘤效果鮮有報道。本研究將葉酸和穿膜肽R8連接到脂質體的表面，制備雙修飾的脂質體，并觀察其功效。

1材料與方法

1.1儀器與試劑BP221S型電子天平(德國賽多利斯)；Mastersizer 2000型激光粒度分析儀(英國馬爾文儀器有限公司)；710 LSMNLO型激光共聚焦顯微鏡(德國卡爾·蔡司公司股份公司)；EPICS XL型流式細胞儀(美國Beckman Coulter公司)；Synergy4型多功能酶標儀(美國BioTek公司)。R8 peptide(Cys-RRRRRRRR，成都凱捷生物科技有限公司)；血管內皮生長因子(VEGF)siRNA和5′-Cy3-VEGF siRNA(百奧邁科有效公司)；FA-PEG2000-DSPE(美國nanocs公司)；蛋黃卵磷脂(EPC，廣州漢方有限公司)；膽固醇(北京鼎國昌盛生物技術有限責任公司)；其他試劑均為分析純。

1.2細胞KB細胞為人口腔表皮癌細胞株，使用含10%胎牛血清的DMEM培養基，并加入100 μg/mL、鏈霉素和100 U/mL青霉素，于37 ℃孵箱中培養，采用0.25%胰蛋白酶傳代消化。

1.3脂質體的制備分別精密稱取EPC、膽固醇、FA-PEG2000-DSPE適量溶于氯仿乙醇溶液(體積比為5∶1)中，超聲使之溶解。將上述磷脂溶液按照1∶9的體積比注入到Hepes緩沖液中，形成脂質體溶液，將穿膜肽R8與磷脂摩爾比為3∶17的比例加入到上述脂質體溶液中，制備葉酸與R8雙修飾的脂質體(FA-R8-LPs)。按照同樣方法，分別制備R8修飾的脂質體(R8-LPs)、葉酸修飾的脂質體(FA-LPs)和空白無修飾脂質體(C-LPs)。為了獲得載有VEGF siRNA的脂質體，首先將上述脂質體溶液過0.22 μm的濾膜除菌，將VEGF siRNA溶于焦碳酸二乙酯(DEPC)水中，將siRNA與脂質體溶液在無菌條件下混合均勻，使得siRNA的終濃度為0.5 mmol/L，將上述載藥脂質體超聲10 s，備用。分別取載有VEGF siRNA的上述脂質體100 μL，用超純水稀釋至1 mL，采用激光粒度分析儀對粒徑和電位進行測定，每個樣品平行測定3次。采用瓊脂糖凝膠電泳方法考察脂質體與siRNA的結合度。首先制備瓊脂糖凝膠，稱取2 g瓊脂糖溶于100 mL TAE緩沖液中，加熱后冷卻，保證沒有氣泡，加入10 μL溴化乙錠溶液，輕搖使其混勻，倒入電泳膠槽，待冷卻后備用。制備脂質體與siRNA溶液，用DEPC水將各樣品總體積補充到10 μL，每個樣品加入2 μL上樣緩沖液，加入上樣槽中，保持電壓在100 mV運行20 min。最后將瓊脂糖膠放于紫外凝膠成像系統中分析。

1.4載有VEGF siRNA脂質體對KB細胞的作用①脂質體載體毒性檢測：將KB細胞計數后，稀釋至1×105/mL濃度，按每孔1×104個細胞接種于96孔培養板，每組設6個平行孔，置于CO2培養箱培養24 h。24 h后，棄培養液，PBS洗3遍，分別設立空白對照組和樣品組，樣品組中未載有siRNA的脂質體包括C-LPs、R8-LPs、FA-LPs和FA-R8-LPs，載有VEGF siRNA的脂質體組樣品包括C-LPs-siRNA、R8-LPs-siRNA、FA-LPs-siRNA、FA-R8-LPs-siRNA，將上述樣品分別加入96孔培養板，培養4 h。棄培養基，加入新鮮培養基，繼續培養24 h后每孔加入10 μL的5 mg/mL的MTT溶液，置于CO2培養箱培養2 h，吸掉溶液后加入100 μL的DMSO，混勻后于540 nm處用酶標儀檢測。②KB細胞對脂質體的攝取：a.采用流式細胞儀檢測。將KB細胞用無葉酸培養基稀釋至1×105/mL濃度，按每孔1×105個細胞接種于24孔培養板中，每組設3個平行孔，置于CO2培養箱培養24 h。24 h后制備不同的VEGF siRNA脂質體樣品，其中VEGF siRNA采用5′-Cy3(紅色熒光)進行標記。棄去培養液，PBS洗3遍，按順序加入制備好的脂質體/siRNA體系樣品，同時設計游離的siRNA(Naked siRNA)組，即未加入任何載體的siRNA組作為對照。分別置于CO2培養箱培養4 h后，消化細胞，離心后加入500 μL 4%的甲醛溶液固定，收集全部溶液置于流式細胞儀測定管中，樣品可在4 ℃避光條件下保存，待用。b.采用激光共聚焦顯微鏡進行觀察。轉染過程同a，加入Naked siRNA和FA-R8-LPs-siRNA樣品。轉染結束后，吸出培養液，洗3次，加入4%的甲醛進行固定，洗去固定液。采用DAPI染色細胞核3 min，洗去染色液，再次用PBS洗3次，置于激光共聚焦顯微鏡下進行拍照。③KB細胞對脂質體的攝取機制：將KB細胞用無葉酸培養基稀釋至1×105/mL濃度，按每孔1×105個細胞接種于24孔培養板中，培養24 h后加入不同的VEGF siRNA脂質體樣品，同時加入蔗糖(網格蛋白介導的內吞作用抑制劑)、制霉菌素(細胞膜介導的的內吞作用)和細胞松弛素D(胞吞作用抑制劑)3種抑制劑與樣品同時孵育4 h。采用流式細胞儀測定細胞的平均熒光強度，初步探索脂質體進入細胞的攝取機制[9]。④KB細胞VEGF蛋白檢測：將KB細胞用無葉酸培養基稀釋至1×105/mL濃度，按每孔2×105個細胞接種于6孔培養板中，培養24 h后加入不同的VEGF siRNA脂質體樣品和無載體樣品Naked siRNA，孵育4 h后加入胎牛血清，繼續培養48 h后，采用細胞裂解液將KB細胞裂解，提取總蛋白，定量蛋白后，采用SDS電泳對蛋白進行分離，轉膜后以GAPDH為內標，分別對GAPDH和VEGF蛋白進行一抗、二抗孵育，顯影后觀察蛋白下調效果。

2結果

FA-R8-LPs、R8-LPs、FA-LPs和C-LPs脂質體粒徑和電位測定結果見表1。與Naked siRNA相比，4種脂質體均與siRNA呈現了不同程度的結合，其中FA-R8-LPs和R8-LPs與siRNA結合效果較好，已基本完全與siRNA結合，C-LPs和FA-LPs與siRNA的結合效果相對較差，siRNA的亮度較明顯。

表1　4種脂質體粒徑和電位比較±s)

注：與C-LPs脂質體比較，*P<0.01。

MTT檢測結果顯示，與空白對照組相比，C-LPs、R8-LPs、FA-LPs和FA-R8-LPs各脂質體對KB細胞無明顯毒性，細胞存活率分別為98.545%、96.334%、97.546%、96.387%。與空白對照組相比，C-LPs-siRNA、R8-LPs-siRNA、FA-LPs-siRNA、FA-R8-LPs-siRNA對腫瘤細胞的抑制率分別為11.446%、25.666%、27.453%、44.527%，后三者與空白對照組比較，P均<0.01。流式細胞儀檢測結果顯示，與空白對照組和Naked siRNA相比，C-LPs-siRNA、R8-LPs-siRNA、FA-LPs-siRNA和FA-R8-LPs-siRNA均有明顯的熒光遷移，其中遷移程度由大到小分別為FA-R8-LPs-siRNA、FA-LPs-siRNA、R8-LPs-siRNA和C-LPs-siRNA。C-LPs-siRNA、R8-LPs-siRNA、FA-LPs-siRNA和FA-R8-LPs-siRNA的平均熒光強度值分別為4.533±0.802、8.467±1.050、11.467±1.504、20.400±2.326，高于空白對照組(0.367±0.058)和Naked siRNA組(2.500±0.854)，P均<0.01。激光共聚焦顯微鏡觀察發現，FA-R8-LPs-siRNA較Naked siRNA將大量siRNA轉染進入到KB細胞內，使得腫瘤細胞的熒光強度明顯增強。

與無抑制劑相比，制霉菌素和細胞松弛素D處理的KB細胞熒光強度值未見明顯變化，而蔗糖作為抑制劑顯著降低了KB細胞的平均熒光強度，見表2。與空白對照組相比，Naked siRNA、C-LPs-siRNA、R8-LPs-siRNA、FA-LPs-siRNA和FA-R8-LPs-siRNA均對VEGF蛋白有一定的抑制效果(P均<0.01)，VEGF蛋白相對下調量分別為11.68%、23.69%、57.77%、54.10%、60.86%。

表2　3種抑制劑處理的KB細胞熒光強度比較±s)

注：與無抑制劑相比，*P<0.01。

3討論

VEGF是最有效的促血管生長因子，對腫瘤新生血管形成及腫瘤生長和轉移起重要作用[10～12]。以VEGF及其受體為靶點，抑制腫瘤的發生與發展是抗癌藥物研究的熱點。本研究制備了葉酸與穿膜肽R8雙修飾的脂質體，同時對一種VEGF siRNA進行裝載，對其功效進行了系統的評價，同時對轉染機制進行了初步考察。希望通過該載體高效地將VEGF siRNA轉染進入到腫瘤細胞，發生RNA干擾[13]現象，降低VEGF的表達，導致腫瘤細胞發生凋亡或死亡的現象，提高抗腫瘤效果。

首先，為了評價制備脂質體的性質是否適用于進入到腫瘤部位，對制備的幾種脂質體進行粒徑和電位進行評價，雙修飾脂質體粒徑為(112.5±3.7)nm，粒徑有利于載體在腫瘤部位的富集，同時具有較強的正電荷，因此利于與帶負電荷的siRNA結合，轉染進入細胞，進而發揮抗腫瘤功效。脂質體與siRNA結合度考察結果顯示，雙修飾的脂質體能夠較好地與siRNA結合，進而有利于進入腫瘤細胞，而葉酸單修飾的脂質體與siRNA的結合能力較弱，可能由于與siRNA產生了陰離子競爭。

MTT實驗結果顯示，雙修飾后的脂質體載體能夠較高效率地將siRNA轉染進入腫瘤細胞，導致細胞出現凋亡或者死亡現象，腫瘤細胞生長抑制率明顯上升，而未載藥的脂質體無明顯毒性，表明脂質體載體安全可靠。流式細胞儀檢測、激光共聚焦顯微鏡觀察KB細胞對脂質體的攝取實驗中，雙修飾的脂質體進入腫瘤細胞明顯，直觀地反映了制備的載體能夠將VEGF siRNA裝載進入腫瘤細胞，釋放核酸藥物，進而實現抗腫瘤效果。同時采用了Western blotting實驗對腫瘤細胞的VEGF蛋白進行測定，發現采用雙修飾脂質體裝載siRNA對腫瘤細胞的VEGF蛋白起到明顯下調效果，這也是導致MTT實驗中細胞出現凋亡或死亡現象的主要原因。

為了對本研究制備的體系進入腫瘤細胞的過程進行探討，進行了細胞內吞機制的初步研究，可初步判斷，脂質體的攝取可能是通過網格蛋白介導的內吞作用。這也為今后對于該載體的進一步體內研究提供了一定的參考和依據。

參考文獻：

[1] Avolio TM, Lee Y, Feng N, et al. RNA interference targeting the R2 subunit of ribonucleotide reductase inhibits growth of tumor cells in vitro and in vivo[J]. Anticancer Drugs, 2007,18(4):377-388.

[2] Lee M, Kim SW. Polyethylene glycol-conjugated copolymers for plasmid DNA delivery[J]. Pharm Res, 2005,22(1):1-10.

[3] Yan Y, Johnston AP, Dodds SJ, et al. Uptake and intracellular fate of disulfide-bonded polymer hydrogel capsules for Doxorubicin delivery to colorectal cancer cells[J]. ACS Nano, 2010,4(5):2928-2936.

[4] 何笑冬,舒小鐳,李少林.雙功能RGD-R8修飾阿霉素脂質體的制備及其體外評價[J].第三軍醫大學學報,2014,36(20):2103-2106.

[5] 張楠,白銀,趙景狀,等.多聚精氨酸融合增強型綠色熒光蛋白制備方法及穿膜效果[J].生物工程學報,2013,29(11):1644-1653.

[6] 張奇,張友九,楊科亞,等.葉酸受體陽性腫瘤細胞對Folate-PGA偶聯酶的特異性結合[J].中國藥理學通報,2007,23(6):746-750.

[7] 閆穎,齊憲榮.以葉酸受體為靶向的陽離子脂質體的制備與性質考察[J].藥學學報,2008,43(11):1134-1139.

[8] 趙潔,夏亞丹,劉艷艷.葉酸偶聯白蛋白納米粒的應用研究進展[J].山東醫藥,2015,55(22):97-99.

[9] Zhang Y, Zhou C, Kwak KJ, et al. Efficient siRNA delivery using a polyamidoamine dendrimer with a modified pentaerythritol core[J]. Pharm Res, 2012,29(6):1627-1636.

[10] 楊輝,徐笑紅.靶向VEGF-C的siRNA表達載體對人乳腺癌細胞VEGF-C基因表達的影響[J].中國現代醫生,2015,53(10):1-3.

[11] 黃秋林,劉璇,陽勇,等.靶向肝癌HepG2細胞VEGF基因siRNA表達載體裸鼠成瘤抑制作用[J].中國現代醫藥雜志,2013,23(14):18-19.

[12] Takahashi S. Vascular endothelial growth factor (VEGF), VEGF receptors and their inhibitors for antiangiogenic tumor therapy[J]. Biol Pharm Bull, 2011,34(12):1785-1788.

[13] Morille M, Passirani C, Vonarbourg A, et al. Progress in developing cationic vectors for non-viral systemic gene therapy against cancer[J]. Biomaterials, 2008,29:3477-3496.

(收稿日期：2015-08-27)

中圖分類號：R318

文獻標志碼：A

文章編號：1002-266X(2016)11-0038-03

doi：10.3969/j.issn.1002-266X.2016.11.014

通信作者：房學東(E-mail: fangxdooo@sina.com)