熊果酸對糖尿病大鼠腎組織的保護作用

陳雪品，成曦爽，涂畫，石亞靜，呂志偉，齊亞娟,2，韓淑英,2 (華北理工大學，河北唐山 063000；2河北省慢性疾病重點實驗室暨唐山市慢性病臨床基礎研究重點實驗室)

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熊果酸對糖尿病大鼠腎組織的保護作用

陳雪品1，成曦爽1，涂畫1，石亞靜1，呂志偉1，齊亞娟1,2，韓淑英1,2(1華北理工大學，河北唐山 063000；2河北省慢性疾病重點實驗室暨唐山市慢性病臨床基礎研究重點實驗室)

摘要：目的觀察熊果酸對糖尿病大鼠腎組織的保護作用。方法將45只SD大鼠隨機分為對照組(NC組，8只)、造模組(37只)。造模組以高脂飼料喂養4周和一次性尾靜脈注射鏈脲佐菌素(30 mg/kg)制備糖尿病大鼠模型。將造模成功的32只大鼠隨機分為模型對照組(MC組)、二甲雙胍組(MF組)、熊果酸高劑量組(UrAH組)及熊果酸低劑量組(UrAL組)。MF組按100 mg/kg灌胃二甲雙胍，UrAH組按100 mg/kg灌胃熊果酸，UrAL組按50 mg/kg灌胃熊果酸，MC組與NC組每天灌胃同體積純水，每天1次，連續6周。分別于給藥前及給藥第2、4、6周測定各組大鼠血糖，給藥6周后測定各組大鼠血清尿酸(UA)、尿素氮(BUN)、肌酐(Scr)，取雙側腎臟稱重并計算腎臟系數，釆用HE染色法在光鏡下觀察大鼠腎組織病理變化。結果與NC組大鼠相比，MC組大鼠腎組織病理損傷重，腎系數大(P<0.01)，血清UA、BUN、Scr水平高(P均<0.01)。與MC組相比，MF組、UrAH組大鼠腎臟病變減輕，腎系數小(P均<0.05)，血清UA、BUN、Scr水平低(P<0.05或<0.01)。結論熊果酸對糖尿病大鼠腎組織有一定的保護作用。

關鍵詞：熊果酸；糖尿病；糖尿病腎病

糖尿病腎病(DN)是糖尿病患者最嚴重的慢性并發癥之一，更是引起終末期腎臟病變的首要因素[1]。DN典型的病理特點為微循環障礙和微血管基底膜增厚[2]。在我國，糖尿病的發病率逐年上升[3]，尋求一種有效治療DN的藥物已成為研究的熱點。熊果酸是一種五環三萜酸類化合物，廣泛存在于梔子、白花蛇舌草、女貞子、山楂等藥用植物中，具有抗腫瘤、抗氧化、抗菌消炎等多種生物學效應[4]。近年來，文獻[5]報道，熊果酸有治療糖尿病的潛在活性，并證實了熊果酸是通過保護糖尿病大鼠的胰島B細胞來降低血糖水平的。但熊果酸是否對糖尿病大鼠腎組織有保護作用尚不清楚，本實驗旨在對此進行探討。

1材料與方法

1.1實驗動物雄性SPF級SD大鼠45只，體質量230～260 g，購自北京華阜康生物科技股份有限公司，許可證號：SCXK(京)2014-0004。大鼠維持飼料購于北京科澳協力飼料有限公司，合格證號：SCXK(京)2014-0010。高脂飼料由北京華阜康生物科技股份有限公司提供，合格證號：SCXK(京)2014-0008。

1.2儀器與試劑羅氏血糖儀及試紙(瑞士羅氏診斷有限公司)。鏈脲佐菌素(STZ)購自西格瑪奧德里奇公司；熊果酸(中國藥品生物制品鑒定所)；鹽酸二甲雙胍片(天津亞寶藥業科技有限公司)；尿酸(UA)、尿素氮(BUN)、肌酐(Scr)試劑盒購自北京瑞正善達生物工程技術有限公司；水合氯醛(西安藻露堂藥業集團康復醫藥有限公司)；羧甲基纖維素鈉(國藥集團化學試劑有限公司)。

1.3大鼠糖尿病模型的制備及熊果酸用法所有SD大鼠適應性喂養1周后隨機分為對照組(NC組，8只)、造模組(37只)。對照組給予普通飼料喂養，造模組給予高脂飼料喂養，所有大鼠自由飲水、進食。高脂飼料喂養4周后，禁食不禁水16 h，造模組尾靜脈注射STZ(用pH 4.5的0.1 mol/L無菌檸檬酸-檸檬酸鈉溶液配成1.5%濃度)30 mg/kg,2 mL/kg尾靜脈注射。STZ注射1周后，所有大鼠禁食不禁水12 h，取尾靜脈血檢測隨機血糖(非禁食上午8:00)，連續3次隨機血糖值≥16.7 mmol/L為造模成功。35只大鼠造模成功，剔除體質量較低或血糖過高的3只大鼠，剩余32只，按隨機數字表法將其分為模型對照組(MC組)、二甲雙胍組(MF組)、熊果酸高劑量組(UrAH組)及熊果酸低劑量組(UrAL組)。MF組按100 mg/kg灌胃二甲雙胍，UrAH組按100 mg/kg灌胃熊果酸，UrAL組按50 mg/kg灌胃熊果酸，MC組與NC組每天灌胃同體積純水。各組均在上午8:00～10:00點灌胃給藥，每天1次，連續6周。

1.4觀察方法給藥期間觀察各組大鼠一般狀態。分別于給藥前及給藥第2、4、6周用血糖儀測定隨機血糖(上午給藥后30 min)1次。給藥6周后禁食12 h，大鼠用10%水合氯醛以3 mL/kg腹腔注射麻醉，經腹主動脈取血并分離血清，靜置2 h后，3 000 r/min離心20 min，取上層血清于EP管中，并存放于-80 ℃冰箱中備用。用全自動生化分析儀測定血清UA、BUN、Scr。大鼠取血后，立即剖腹取雙側腎臟(剝離腎臟周圍脂肪)，用濾紙吸干腎臟表面血液后稱重，計算腎臟系數，腎臟系數=雙側腎臟質量(mg)/體質量(g)。腎臟稱重后迅速固定于4%多聚甲醛中，取出腎臟，沖洗，梯度乙醇脫水、二甲苯透明、浸蠟、包埋、切片后，HE染色，于OLYMPUS BX50高倍顯微鏡下觀察組織形態改變并用病理圖像分析系統記錄和拍照。

2結果

除NC組外，其他各組大鼠自造模之日起均出現多飲、多食、多尿、體質量減輕癥狀，精神萎靡，反應遲鈍，毛發光澤度降低。各組大鼠血糖水平比較見表1。各組大鼠血清Scr、BUN、UA水平及腎臟系數比較見表2。HE染色結果顯示，NC組腎組織形態正常，腎小球形態規則，腎小管排列緊密，結構清晰，腎小管上皮細胞形態無異常改變。MC組大鼠腎小球體積增大，基底膜不完整；腎間質有炎細胞浸潤及纖維組織的增生，腎小管上皮細胞明顯水腫。UrAH組腎小球形態結構改變明顯減輕，腎間質僅有少量炎細胞浸潤及纖維組織的增生，腎小管上皮細胞輕度水腫。MF組腎組織病理改與UrAH組相近。UrAL組腎組織形態結構改變輕于MC組，腎間質有散在炎癥細胞浸潤及纖維組織的增生，腎小管上皮細胞中度水腫。

3討論

高血糖是引起糖尿病微血管并發癥的根本原因,血糖控制效果不佳的患者，腎臟的病變發展相對更快[6,7]。腎臟長期處于高血糖水平，通過糖基化終末產物的形成，促進氧化應激，進一步激活細胞內的信號轉導通路，導致腎組織損傷，加劇DN的發生發展[8,9]。

表1　各組大鼠血糖水平比較

注：與NC組比較，△P<0.05，▲P<0.01；與MC組比較，*P<0.05，#P<0.01。

表2　　　　各組大鼠血清Scr、BUN、UA水平

注：與NC組比較，△P<0.05，▲P<0.01；與MC組比較，*P<0.05，#P<0.01。

有文獻[11]指出,微炎癥狀態也與糖尿病及糖尿病腎損傷有密切聯系，尋找一種有效控制糖尿病腎損傷及其炎癥反應的藥物，已成為臨床研究的焦點。熊果酸可改善糖尿病及其并發癥癥狀[10,11]。熊果酸可以通過增加肝糖原形成，從而降低血糖水平[12]。另外，熊果酸也能抑制糖尿病誘導腎皮質中的誘導型一氧化氮合成酶過表達，用來治療糖尿病性腎病變[13]。因此，為進一步研究熊果酸對糖尿病大鼠腎損傷的抑制作用，我們采用30 mg/kg劑量的STZ大鼠尾靜脈注射的方法成功制備了糖尿病大鼠模型。本研究結果表明，MC組大鼠血清Scr、BUN、UA水平均升高，腎組織病變明顯，這些現象都說明糖尿病大鼠己出現早期的DN癥狀。UrAH治療組血清Scr、BUN、UA和隨機血糖均降低，腎臟系數減小，說明熊果酸可使腎組織病變減輕，從而保護受損的腎功能，延緩DN的進展。腎組織病理切片亦表明，100 mg/kg熊果酸能減輕糖尿病大鼠腎損傷，治療效果與二甲雙胍相當。

可見，熊果酸能通過降低血糖，糾正糖尿病大鼠的糖代謝紊亂，改善腎小管間質纖維化及炎癥反應，從而發揮保護腎臟的作用，其確切機制有待進一步研究。

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(收稿日期：2015-11-17)

中圖分類號：R587

文獻標志碼：A

文章編號：1002-266X(2016)11-0028-03

doi：10.3969/j.issn.1002-266X.2016.11.010

通信作者：韓淑英(E-mail: shuyinghan59@126.com)

基金項目：國家自然科學基金資助項目(81471022)；國家級大學生創新實驗計劃項目(201510081006)；華北理工大學大學生創新實驗計劃項目(X2015006)。