骨髓間充質干細胞旁分泌效應對胰腺β細胞增殖、凋亡及分泌功能的影響

許聿新，井慶平，趙翠紅(淄博市第一醫院，山東淄博255200)

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·論著·

骨髓間充質干細胞旁分泌效應對胰腺β細胞增殖、凋亡及分泌功能的影響

許聿新，井慶平，趙翠紅(淄博市第一醫院，山東淄博255200)

摘要：目的觀察骨髓間充質干細胞(BMSCs)旁分泌效應對胰腺β細胞系INS-1細胞增殖、凋亡及胰島素分泌的影響。方法培養BMSCs，以胰腺提取物(RPE)模擬胰腺微環境培養BMSCs后，獲取BMSCs的條件培養液(BMSCs-CM)。將細胞分為A組、B組、C組，分別以BMSCs-CM、不含RPE的條件培養液、等量RPMI 1640培養液培養。采用MTT法觀察各組細胞增殖情況，計算細胞增殖率。采用AnnexinⅤ/PI法觀察各組細胞凋亡情況，計算細胞凋亡率。應用放射免疫法(RIA)測定各組胰島素水平。結果 A組細胞增殖率高于B組及C組(P均<0.05)。A組細胞凋亡率低于B組及C組(P均<0.05)。在葡萄糖溶液終濃度為5.6及20.0 mmol/L時，A組胰島素水平均高于B組及C組(P均<0.05)。結論BMSCs-CM培養INS-1細胞后可促進其增殖、抑制其凋亡并促進其分泌胰島素，BMSCs可能通過旁分泌效應發揮以上作用。

關鍵詞：干細胞，骨髓；胰腺β細胞；細胞因子；凋亡；增殖

糖尿病的主要發病機制之一為胰島β細胞的增殖及凋亡失衡，導致胰島β細胞團不足，不能分泌充足的胰島素。骨髓間充質干細胞(BMSCs)是重要的種子細胞，移植BMSCs到胰腺后可以改善糖尿病大鼠的高血糖狀態，但其機制尚未明確[1,2]。研究發現，移植到體內的BMSCs并不能直接分化為胰島素分泌細胞，從而增殖為有功能的胰島β細胞團[3]。但BMSCs在不同的微環境影響下可以分泌不同的細胞因子，從而調節周圍細胞的增殖、凋亡及血管生成等，發揮重要的旁分泌作用。因此，BMSCs旁分泌效應可能在改善靶器官功能、抗凋亡方面發揮重要的作用。我們前期研究發現，以胰腺提取物(RPE)模擬胰腺微環境培養BMSCs后，可使BMSCs通過旁分泌效應分泌多種對胰腺具有保護作用的細胞因子[4]。但這種BMSCs旁分泌效應對胰腺β細胞增殖、凋亡及胰島素分泌的影響尚不明確。 2015 年1～6月，我們用RPE處理BMSCs后的條件培養液(BMSCs-CM)孵育胰腺β細胞系胰島細胞瘤INS-1細胞，觀察BMSCs旁分泌效應對INS-1細胞增殖、凋亡及胰島素分泌的影響，探討BMSCs移植治療糖尿病的機制。

1材料與方法

1.1動物及試劑雄性Wistar大鼠20只，體質量160～220 g，6～8周齡，清潔級，購自山東大學實驗動物中心。大鼠INS-1細胞由佛羅里達大學醫學院饋贈。主要試劑：RPE參照文獻[4]制備，包含胰腺中多種多肽及細胞因子；FITC-羊抗鼠二抗IgG(Beckman Coulter公司)；PI(美國Sigma公司)；AnnexinⅤ-FITC(美國BD公司)。

1.2BMSCs培養及鑒定處死大鼠，采用全骨髓貼壁培養法分離培養BMSCs。48 h后，可見少量貼壁細胞，經過3代后BMSCs基本達到形態均一。流式細胞儀分析第3代BMSCs細胞表型，以細胞高表達CD44和CD90，而CD34、CD45低表達或表達陰性，為BMSCs培養成功。

1.3BMSCs-CM制備[5,6]取第3代BMSCs，培養于含10%FBS的LG-DMEM的培養板中，培養基中加入RPE培養7 d，然后用無血清培養液繼續培養48 h，獲得BMSCs-CM。

1.4分組及干預方法將INS-1細胞分為A組、B組、C組，分別以BMSCs-CM、不含RPE的條件培養液、等量RPMI 1640培養液培養。

1.5BMSCs-CM對INS-1細胞增殖的影響觀察采用MTT法。INS-1細胞接種于96孔板，每孔100 μL，5×103個/孔，培養24 h。各組處理同1.4。每組設5個復孔，培養44 h。吸去上清，加入新鮮RPMI 1640培養液80 μL，再加入MTT溶液，繼續培養4 h。每孔加入二甲基亞砜溶解產物150 μL。在酶聯免疫檢測儀490 nm處測量各孔的吸光度值(OD)，每組設定6復孔。細胞增殖率=(實驗組平均OD值-對照孔平均OD值)/對照孔平均OD值×100%。

1.6BMSCs-CM對INS-1細胞凋亡的影響觀察采用AnnexinⅤ/PI法。INS-1細胞培養于含10%FBS的RPMI 1640培養液的24孔板，約5×105/孔，培養24 h后，改為無血清的RPMI 1640培養液。各組處理同1.4。孵育24 h后，添加促凋亡細胞因子混合物(IL-1β 10 ng/mL、TNF-α 50 ng/mL及 IFN-γ 50 ng/mL)孵育18 h。收集細胞，重懸于195 μL結合液。加入Annexin V-FITC 5 μL，室溫避光孵育10 min。加入結合液重懸細胞，碘化丙啶染色。熒光顯微鏡觀察凋亡細胞，正常INS-1細胞不被熒光標記，早期凋亡細胞被Annexin V染色，鏡下呈綠色；晚期凋亡細胞或壞死細胞被PI染色或同時被Annexin V及PI染色，鏡下見細胞核呈紅色，或細胞核的紅色和細胞膜的綠色同時存在。隨機選取6個視野，流式細胞儀計數早期凋亡細胞數、晚期凋亡數及凋亡細胞總數。細胞凋亡率=凋亡細胞總數/細胞總數×100%。

1.7BMSCs-CM對INS-1細胞胰島素分泌的影響觀察INS-1細胞培養于24孔板中，調整細胞數為5×104/L，孵育48 h。各組處理同1.4。溫箱孵育48 h。每孔中加入葡萄糖溶液，調整終濃度分別為5.6 mmol/L及20.0 mmol/L，孵育4 h，取樣500 μL，應用放射免疫法(RIA)測定胰島素濃度。

2結果

2.1BMSCs-CM對INS-1細胞增殖的影響A組細胞增殖率高于B組及C組(P均<0.05)。B組與C組細胞增殖率差異無統計學意義(P>0.05)。見表1。

2.2BMSCs-CM對INS-1細胞凋亡的影響 A組細胞凋亡率低于B組及C組(P均<0.05)。三組早期及晚期凋亡細胞數差異均無統計學意義(P均>0.05)。見表1。

2.3BMSCs-CM對INS-1細胞胰島素分泌的影響在葡萄糖溶液終濃度為5.6 mmol/L及20.0 mmol/L時，A組胰島素水平高于B組及C組(P均<0.05)。見表1。

表1　三組細胞增殖率、凋亡率、凋亡細胞數及胰島素水平比較±s)

注：與A組比較，*P<0.05。

3討論

BMSCs在不同微環境下的調控下，可以分泌不同的細胞因子，這種效應被稱為BMSCs旁分泌效應[7]。BMSCs分泌的多種細胞因子可通過作用于鄰近細胞而發揮旁分泌作用，廣泛參與細胞增殖、凋亡、免疫調節、血管再生等病理生理過程[8]。研究發現，低氧環境培養BMSCs后，培養液中多種具有心肌保護作用的細胞因子表達上調，表明BMSCs旁分泌效應可能發揮抑制心肌細胞的凋亡，促進其增殖的作用[9,10]。應用模擬胰腺微環境的RPE預處理后，BMSCs可以顯著增加具有胰腺保護作用的細胞因子的分泌，也表明BMSCs旁分泌效應可能發揮修復胰腺的作用。由于BMSCs移植到糖尿病模型體內并不能分化為胰島素分泌細胞、替代受損的胰島細胞，因此考慮高血糖的緩解可能與BMSCs移植后通過旁分泌效應分泌多種降血糖細胞因子有關，進而促進內源性胰島細胞增殖、抑制其凋亡。

胰島β細胞數量的維持是β細胞增殖及凋亡的動態平衡。正常成年胰腺β細胞被認為是相對分化成熟的細胞，但被細胞因子激活后可出現增殖，這些細胞因子主要有胰島素樣生長因子(IGF-1)、肝細胞生長因子(HGF)、堿性成纖維細胞生長因子(bFGF)、VEGF等[11]。它們與細胞表面的受體相結合后，可發揮促進有絲分裂、促進細胞增殖、抑制細胞凋亡、修復損傷的作用。研究發現，應用IGF-1處理胰島β細胞可以抑制細胞因子誘導的胰島β細胞凋亡，減少NO的合成，促進胰島細胞分泌胰島素[12]。HGF可通過對抗氧化應激來減少游離脂肪酸誘導的RINm5F凋亡，對胰島細胞具有促進增殖的作用[13]。bFGF及VEGF不僅對胰腺細胞具有促增殖作用，還可通過促進血管生成改善胰腺血供、促進胰腺修復[14,15]。本研究發現， A組增殖率高于B組及C組，提示應用REP制備的BMSCs-CM可促進INS-1細胞的增殖；A組細胞凋亡率低于B組及C組，提示BMSCs-CM可抑制IL-1β、TNF-α和IFN-γ誘導的INS-1細胞的凋亡；在葡萄糖溶液終濃度為5.6 mmol/L及20.0 mmol/L時，A組胰島素水平均高于B組及C組，提示BMSCs-CM可促進INS-1細胞分泌胰島素的能力，考慮以上效應均與BMSCs通過旁分泌效應分泌具有胰腺保護作用的細胞因子有關。

綜上所述，BMSCs-CM培養INS-1細胞后可促進INS-1細胞的增殖、抑制其凋亡并促進其分泌胰島素，BMSCs可能通過分泌多種胰腺保護細胞因子的旁分泌效應發揮以上作用，可能是移植BMSCs后逆轉高血糖狀態的重要機制。

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Influence of paracrine effects of bone mesenchymal stem cells on proliferation,apoptosis and secretion function of pancreatic β cell line

XUYuxin,JINGQingping,ZHAOCuihong

(TheFirstHospitalofZibo,Zibo255200,China)

Abstract:ObjectiveTo investigate the influence of paracrine effects of bone mesenchymal stem cells (BMSCs) on the proliferation, apoptosis and insulin secretion of pancreatic β cell line INS-1 cells. MethodsThe BMSCs were cultured and BMSCs conditioned media (BMSCs-CM) were obtained by culturing BMSCs with rat pancreatic extracts (RPE) which simulated the pancreatic microenvironment. The INS-1 cells were divided into groups A, B and C, which were cultured with BMSCs-CM, conditioned media without RPE and RPMI 1640 culture solution, respectively. The influence of BMSCs-CM on INS-1 cell proliferation was analyzed by MTT. The cell proliferation rate was calculated. The effects of BMSCs-CM on the INS-1 cell apoptosis were measured by AnnexinⅤ/PI double staining. The rate of apoptosis was counted. The insulin concentration of INS-1 cells was analyzed by radioimmunoassay (RIA).ResultsThe cell proliferation rate in the group A was higher than that in group B and C (P<0.05). The apoptosis rate in the group A was lower than that in group B and C (P<0.05). The insulin concentration in the group A was higher than that in group B and C at the concentration of 5.6 mmol/L and 20.0 mmol/L (all P<0.05).ConclusionsThe incubation of BMSCs-CM can stimulate the INS-1 cell proliferation, inhibit the apoptosis, and promote the insulin secretion. The above actions of BMSCs may be achieved by paracrine effects.

Key words:stem cells, myeloid; pancreatic β cells; cytokines; apoptosis; proliferation

(收稿日期：2015-10-19)

中圖分類號：R587.1

文獻標志碼：A

文章編號：1002-266X(2016)14-0001-03

doi：10.3969/j.issn.1002-266X.2016.14.001

通信作者簡介：井慶平(1964-),男，本科，主治醫師，主要研究方向為糖尿病慢性并發癥的診治。E-mail: jingqingping@sina.com

第一作者簡介：許聿新(1978-),男，博士，主治醫師，主要研究方向為糖尿病慢性并發癥的診治。E-mail: hongxin1978@sina.com

基金項目：山東省淄博市科學技術發展計劃項目(2012GG01259)。