粒細胞集落刺激因子保護急性損傷人胎肝細胞的實驗研究

孫子健，陳 婧，夏衍珩，劉曉燕，蘇海濱，楊昊臻，許 祥，胡瑾華

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粒細胞集落刺激因子保護急性損傷人胎肝細胞的實驗研究

孫子健，陳 婧，夏衍珩，劉曉燕，蘇海濱，楊昊臻，許 祥，胡瑾華

[摘要]目的 建立D-半乳糖胺（D-galactosamine，D-GalN）對人胎肝細胞急性損傷的模型，觀察粒細胞集落刺激因子（Granulocyte-colony stimulating factor, G-CSF）對人胎肝細胞損傷的保護作用。方法 分別用梯度濃度的D-GalN和不同的作用時間孵育人胎肝細胞，用四唑鹽比色法（MTT法）檢測細胞活性，以確定最佳的人胎肝細胞急性損傷造模條件。將胎肝細胞分為4組進行不同處理：第1組為空白對照組，第2組（G組）用G-CSF處理正常細胞，第3組（ND組）和第4組（GD組）都用D-GalN進行損傷造模，但GD組加入G-CSF作為治療，第3組加入等量的0.9％氯化鈉溶液作為實驗對照。最后用MTT法和乳酸脫氫酶（LDH）釋放量檢測各組細胞活性。結(jié)果 當D-GalN濃度為10 mg/ml，作用時間為12 h時，可以殺傷90％以上的人胎肝細胞，并且可以保證有足夠的藥物反應時間。空白對照組和G組的細胞活性差異無統(tǒng)計學差異，但GD組細胞活性明顯高于ND組（P＜0.05）。結(jié)論 D-GalN對人胎肝細胞急性損傷的造模條件為D-GalN 10 mg/ml作用12 h。G-CSF對D-GalN造成的人胎肝細胞急性損傷具有保護作用。

[關(guān)鍵詞]肝功能衰竭; 人胎肝細胞; 粒細胞集落刺激因子

[作者單位] 100039 ，北京大學解放軍第三〇二醫(yī)院教學醫(yī)院肝衰竭診療與研究中心（孫子健、夏衍珩、許祥、胡瑾華）；100039 北京，解放軍第三〇二醫(yī)院肝衰竭診療與研究中心（陳 婧、劉曉燕、蘇海濱、楊昊臻、胡瑾華）

急性肝衰竭病因復雜，患者肝功能喪失迅速，病情危急，病死率極高，但缺乏有效治療手段[1]。近年來應用粒細胞集落刺激因子（granulocytecolony stimulating factor, G-CSF）治療肝衰竭已在肝衰竭動物模型中得到驗證，臨床試驗也取得了一定效果[2-4]。傳統(tǒng)觀點認為G-CSF主要通過促進骨髓干細胞及肝干細胞（肝卵圓細胞）在肝臟內(nèi)的增殖以修復肝臟[5-6]，這一過程體現(xiàn)在肝功能或肝組織的恢復需要一定的時間。然而不論是臨床觀察還是動物實驗中，我們發(fā)現(xiàn)經(jīng)過G-CSF治療的患者或模型小鼠在治療早期均有顯著的肝功能改善，推測G-CSF可能通過某種機制直接保護肝臟細胞。本研究設(shè)計體外實驗，用D-半乳糖胺（D-galactosamine, D-GalN）對人胎肝細胞造成急性損傷，觀察G-CSF是否對人胎肝細胞急性損傷具有保護治療作用。

1　材料與方法

1.1材料 人胎肝細胞由上海東方肝膽外科醫(yī)院贈予，在配有5％胎牛血清和1％青霉素-鏈霉素的杜爾伯科改良伊格爾培養(yǎng)基（dulbecco modified eagle medium，DMEM）中貼壁生長，置于37 ℃含95％空氣加5％二氧化碳混合氣體的細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

1.2人胎肝細胞急性損傷造模 胎肝細胞以2×105/孔的密度在12孔板中貼壁穩(wěn)定生長后，用不含血清的DMEM培養(yǎng)細胞12 h進行饑餓處理。D-GalN用DMEM溶解至濃度為8、9、10和11 mg/ml，以0.4 ml的體積加入各孔，測試12 h內(nèi)不同濃度藥物對胎肝細胞的殺傷力，再選出適宜濃度同法分別孵育細胞0、4、6、8、10、12和14 h 以確定合適的作用時間，2種試驗均以四唑鹽比色法（MTT法）對細胞活性進行檢測。MTT用DMEM溶解后定容至0.5 mg/ml，每孔加入0.2 ml孵育細胞4 h，吸除MTT液，再每孔加入0.2 ml二甲基亞砜（dimethyl sulphoxide, DMSO）充分溶解細胞后，從每孔中吸取0.1 ml加入96孔板，用分光光度儀測A490 nm時的吸光度。

1.3G-CSF對胎肝細胞的保護作用 如前所述將胎肝細胞鋪至12孔板，隨機分為4組：①空白對照組；② G-CSF組（G組）：G-CSF處理正常人胎肝細胞；③實驗對照組（ND組）：0.9％氯化鈉溶液處理人胎肝細胞急性損傷模型；④治療組（GD組）：G-CSF處理人胎肝細胞急性損傷模型。對4組分別做如下處理：首先進行饑餓處理，將G-CSF（北京雙鷺藥業(yè)）用不含血清DMEM配置成10 μg/ml濃度，以0.4 ml體積加入G組和GD組，同時將相同體積的無血清DMEM加入空白對照組和ND組，共同孵育12 h。隨后空白對照組和G組不進行處理，而對ND組及GD組進行造模處理（D-GalN濃度由前述實驗獲得），ND組加入0.4 ml溶有濃度為10 mg/ml D-GalN的無血清DMEM（其中混有與GD組內(nèi)G-CSF等體積的0.9％氯化鈉溶液），GD組則加入0.4 ml溶有 D-GalN 和G-CSF的無血清DMEM，其濃度分別為10 mg/ml 和10 μg/ml。以上4組再共同培養(yǎng)12 h，對細胞活性進行檢測，除了繼續(xù)應用上述的MTT法外，同時抽取細胞培養(yǎng)液進行乳酸脫氫酶（LDH）的濃度測定。

1.4統(tǒng)計學處理 用SPSS19.0軟件進行統(tǒng)計分析。計量資料呈正態(tài)分布或近似正態(tài)分布，用±s表示。2組間計量資料比較用成組t檢驗（組間方差齊）。P＜0.05表示差異有統(tǒng)計學意義。

2　結(jié)果

2.1最佳的人胎肝細胞急性損傷造模條件的確定 分別用梯度濃度的D-GalN孵育人胎肝細胞12 h，可見當濃度達到10 mg/ml以上時，可殺傷90％以上的胎肝細胞（表1）。為確定適宜的D-GalN作用時間，我們又以10 mg/ml的濃度孵育胎肝細胞，觀察到作用時間為4 h 時，可殺傷約50％的細胞，隨著作用時間的延長，殺傷程度加重，當D-GalN孵育12 h，細胞損傷90％以上（表2）。因此綜合以上情況選擇的造模條件為D-GalN濃度10 mg/ml，作用時間12 h，這樣既可以劇烈殺傷胎肝細胞（＞90％），又能保證進一步檢測G-CSF保護作用有足夠的反應窗口期。

表1　MTT法檢測梯度濃度D-GalN對人胎肝細胞的殺傷作用（±s）Table 1 Injury effect of D-GalN at gradient concentrations on human fetal hepatocytes detected by MTT method (±s)

表1　MTT法檢測梯度濃度D-GalN對人胎肝細胞的殺傷作用（±s）Table 1 Injury effect of D-GalN at gradient concentrations on human fetal hepatocytes detected by MTT method (±s)

D-GalN 濃度（mg/ml）　0　8　9　10　11 MTT吸光度（標準化OD值）　1.000±0.019　0.299±0.012　0.172±0.037　0.087±0.031　0.073±0.032

表2　MTT法檢測在濃度為10 mg/ml 的D-GalN不同時間對人胎肝細胞的殺傷作用（±s）Table 2 Injury effect of D-GalN at the concentration of 10 mg/ml on human fetal hepatocytes detected by MTT method at different time points (±s)

表2　MTT法檢測在濃度為10 mg/ml 的D-GalN不同時間對人胎肝細胞的殺傷作用（±s）Table 2 Injury effect of D-GalN at the concentration of 10 mg/ml on human fetal hepatocytes detected by MTT method at different time points (±s)

作用時間（h）　0　4　6　8　10　12　14 MTT吸光度（標準化OD值） 1.000±0.157 0.515±0.032 0.323±0.101 0.274±0.007 0.130±0.027 0.095±0.005 0.015±0.002

2.2G-CSF對D-GalN造成人胎肝細胞急性損傷保護作用測定 用濃度為10 mg/ml 的D-GalN作用12 h后檢測人胎肝細胞活性，結(jié)果如下。

2.2.1MTT法檢測結(jié)果 MTT法檢測的是活細胞與試劑的反應能力，以吸光度值表示，值愈大代表細胞存活數(shù)量愈多，檢測結(jié)果見表3。空白對照組與G組吸光度差異無統(tǒng)計學意義（t=1.425, P=0.227）；ND組吸光度明顯低于空白對照組（t=42.581, P=0.000）；GD組吸光度明顯高于ND組（t=3.029，P=0.013）。

2.2.2LDH法檢測結(jié)果 LDH是在細胞死亡破裂時釋放出來，因此LDH的值越高表示細胞死亡量越大。檢測結(jié)果見表4。空白對照組與G組LDH濃度差異無統(tǒng)計學意義（t=0.316，P=0.768），ND組LDH濃度明顯高于空白對照組（t=10.301，P=0.000），GD組LDH濃度明顯低于ND組（t=6.779，P=0.000）。

表3　MTT法檢測4組人胎肝細胞吸光度（ 標準化OD值,±s）Table 3 Absorbance of human fetal hepatocytes of the 4 groups detected by MTT method (standard OD,±s)

表3　MTT法檢測4組人胎肝細胞吸光度（ 標準化OD值,±s）Table 3 Absorbance of human fetal hepatocytes of the 4 groups detected by MTT method (standard OD,±s)

組別　n　吸光度空白對照組　6　1.000±0.008 G組　6　0.956±0.011 ND組　6　0.164±0.032 GD組　6　0.221±0.033

表4　LDH法檢測4組人胎肝細胞LDH濃度（U/L,±s）Table 4 Concentrations of LDH in fetal hepatocytes of the 4 groups detected by LDH method(U/L,±s)

表4　LDH法檢測4組人胎肝細胞LDH濃度（U/L,±s）Table 4 Concentrations of LDH in fetal hepatocytes of the 4 groups detected by LDH method(U/L,±s)

組別　n　LDH濃度空白對照組　6　1.0±0.0 G組　6　1.0±0.0 ND組　6　20.7±4.7 GD組　6　4.0±3.8

空白對照組與G組人胎肝細胞存活數(shù)量差異無統(tǒng)計學意義，提示G-CSF對人胎肝細胞無損傷作用；ND組明顯低于空白對照組，提示造模成功；GD組明顯高于ND組，提示提示G-CSF對D-GalN所致的人胎肝細胞損傷具有直接保護作用。

3　討論

D-GalN有特異的肝毒性，能夠耗盡肝細胞內(nèi)的三磷酸尿苷，從而阻斷小分子化合物的合成，繼而引起肝細胞的凋亡。它的這一特性已廣泛應用于肝損傷的動物實驗模型[7]，我們也選擇D-GalN進行造模。人類原代肝細胞被認為是體外研究肝病最理想的實驗對象，但獲取效率極低且實驗難度高，而人胎肝細胞因其仍可增殖而易于培養(yǎng)，并且已具備一系列肝細胞基因的表達，已較多地應用于肝臟疾病的體外研究[8]。我們首次成功在體外應用D-GalN對人胎肝細胞制作急性損傷模型，10 mg/ml D-GalN作用于人胎肝細胞12 h后即可造成90％以上的細胞損傷，同時也保證進一步驗證G-CSF保護作用所需的反應窗口期。這一模型的構(gòu)建，為探究G-CSF對胎肝細胞的直接作用提供了便利。MTT法可用于檢測細胞活性和藥物毒性，而利用死亡細胞釋放LDH的量來評定細胞存活程度是更為精準的方法[9]。在判定G-CSF對胎肝細胞保護作用時，我們同時應用了這2種檢測方法，以提高實驗結(jié)果的準確性。我們的實驗發(fā)現(xiàn)ND組與GD組相比，無論從MTT法還是LDH法的測定結(jié)果來看，GD組的細胞都顯示了更高的細胞活性，證實G-CSF在體外可以直接保護人胎肝細胞減輕D-GalN的毒害作用，并且此保護作用相當顯著。

關(guān)于G-CSF保護人胎肝細胞的機制，我們考慮一是由于G-CSF可能會幫助胎肝細胞增殖來維持較高的細胞活性，二是G-CSF可能直接保護胎肝細胞抵御凋亡壞死。對于第一種可能，從表3 和4的空白對照組和G組結(jié)果來看，G-CSF對胎肝細胞并無增殖作用。而對第二種可能，已有研究者在許多腦缺血和心肌梗死的實驗中發(fā)現(xiàn)G-CSF能通過抵抗凋亡來保護神經(jīng)元和心肌細胞[10-11]。因此我們設(shè)想G-CSF對于人胎肝細胞的保護也可能是通過抗凋亡作用實現(xiàn)的，對于其具體的分子機制，以及是否適用于原代肝細胞和體內(nèi)實驗，還需后續(xù)的實驗驗證。

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（2015-12-30 收稿 2016-02-20 修回）

（責任編委 王永怡 本文編輯 張云輝）

Protective effect of granulocyte-colony stimulating factor on acute injury of human fetal hepatocytes

SUN Zi-jian, CHEN Jing, XIA Yan-heng, LIU Xiao-yan, SU Hai-bin, YANG Hao-zhen, XU Xiang, HU Jin-hua*
Liver Failure Treatment and Research Center, 302 Military Hospital of China-Peking University Teaching Hospital, Beijing 100039, China
*Corresponding author, E-mail: hjh@medmail.com.cn

[Abstract]Objective To establish the model of acute injury of human fetal hepatocytes induced by D-galactosamine (D-GalN) and observe the protective effect of granulocyte-colony stimulating factor (G-CSF) on the injury of fetal hepatocytes. Methods The human fetal hepatocytes were hatched by gradient concentrations of D-GalN at different action time, and their activities were detected by MTT assay, in order to determine the optimal conditions for establishing the model of acute injury of human fetal hepatocytes. The human fetal hepatocytes were divided into 4 groups, which received different treatments: the first group (control group) was the blank control group; normal fetal hepatocytes of the second group (group G) were treated with G-CSF; the injury was induced by D-GalN in both the third group (group ND) and the fourth group (group GD), but the human fetal hepatocytes of group GD were treated with G-CSF, and those of group ND with the same amount of normal saline instead of G-CSF. The activities of the hepatocytes of each group were detected by both MTT assay and LDH release assay. Results More than 90％ of human fetal hepatocytes could be killed by D-GalN at the concentration of 10 mg/ml for 12 hours. The medicine had enough time to play its protective effect. The activities of the hepatocytes were not significantly different between the control group and group G, while that of group GD was significantly higher than that of group ND (P<0.05). Conclusions The model of acute injury of human fetal hepatocytes can be established by D-GalN at the concentration of 10 mg/ml for 12 hours. G-CSF has a protective effect on the acute injury of human fetal hepatocytes induced by D-GalN.

[Key words]liver failure; human fetal hepatocytes; granulocyte-colony stimulating factor

[通訊作者]胡瑾華，E-mail: hjh@medmail.com.cn

[基金項目]國家自然基金面上項目（81171641）；北京市科技計劃 首都特色臨床應用研究項目（Z131107002213157）

DOI:10.3969/j.issn.1007-8134.2016.02.007

[文獻標志碼][中國圖書資料分類號] R512.62 A

[文章編號]1007-8134(2016)02-0089-03