閉合蛋白Occludin在畜禽腸道屏障中的調節作用

方成堃+何邵平+賀建華

摘要：腸道是動物消化食物、吸收營養的主要場所。閉合蛋白Occludin作為細胞緊密連接的重要組成部分，發揮封閉細胞間隙、形成機體滲透屏障、保持細胞兩側物質差異的作用。本文綜述了閉合蛋白Occludin在調控畜禽腸道健康中的作用及影響其蛋白表達的一些因素。

關鍵詞：閉合蛋白；腸道健康；調控作用

小腸是動物吸收營養物質的主要場所。但是，由于各種外界因素的應激，使得動物常常出現食欲差、消化功能紊亂等問題，從而導致腸道屏障受損，腸絨毛萎縮，隱窩深度加大，進而出現腹瀉和生長緩慢的現象。作為上皮細胞間連接的一種主要形式，緊密連接（Tight Junction）對維護上皮細胞兩側物質的差異和保持細胞極性起著重要的作用。緊密連接是由一系列跨膜蛋白和外周蛋白相互作用而形成的一個復雜的蛋白質體系，能被多種方式所調控。閉合蛋白是其中最重要的蛋白質分子之一，上皮細胞通過Occludin蛋白封閉細胞間隙，并與ZO-1等結合形成緊密連接的基礎結構。Occludin蛋白功能狀態與多種疾病的發生、發展相關，有著重要的臨床意義。

1閉合蛋白Occludin的結構

閉合蛋白（Occludin）最早是由Furuse等發現的，其定位于雞肝緊密連接的膜內在蛋白，由504個氨基酸殘基組成，相對分子質量是64×103，另有4個跨膜結構域。氨基端和羧基端均位于細胞質區，2個富含絲氨酸、蘇氨酸和酪氨酸殘基的細胞外環，一個由10個氨基酸殘基組成的細胞內環。在N-端，氨基截短的閉合蛋白Occludin可精確地結合到緊密連接上，并能與ZO-1相結合，但熒光示蹤劑的通透性上升，無法維持較高的跨細胞電阻。研究表明，N-末端縮短的閉合蛋白Occludin位于小鼠上皮細胞系CSG120/7上。通過電生理學測定結果表明，N-末端縮短結構將對緊密連接的屏障功能產生不利影響。另有研究表明，在轉染的狗的腎臟細胞中，C-末端縮短的閉合蛋白Occludin能夠精確定位在緊密連接上。C-端截短的雞閉合蛋白Occludin可被整合至緊密連接中，但會導致細胞間通透性的增加，導入正常的閉合蛋白Occludin的mRNA可糾正，在羧基段含有一個疏水（coiled-coil）結構域。這個結構域是與ZO-1的氨基端結合的位點，ZO-1的羧基段結構域再與細胞內骨架蛋白結合。Coiled-coil結構域也是磷脂酰肌醇-3（PI-3）激酶等調節蛋白作用的位點。

2閉合蛋白Occludin的功能

閉合蛋白Occludin的最主要功能是參與維持緊密連接的屏障功能，對Raf1介導的腫瘤發生有強烈的抑制作用。比如，在犬腎細胞系（MDCK）中過量表達的閉合蛋白Occludin會提高經上皮細胞的跨膜電阻，并且用合成肽模擬細胞外的閉合蛋白Occludin的循環結構被指出會其使正常的回路斷裂從而使上皮細胞的通透新增加。在滅活鼠中試驗中，研究者指出緊密連接具有復雜的表觀組織學特征，即使上皮組織中有慢性炎癥反應，但是緊密連接在形態學上是完整的，意味著在緊密連接中閉合蛋白Occludin有可能更多的是擔任一個維持其穩定性和屏障功能的角色。同時指出，在皮層肌動蛋白組織和不同的內皮細胞模型的屏障功能中閉合蛋白Occludin是必不可少的。通過閉合蛋白Occludin可下調蛋白水解和透性化因素處理的血管內皮生長因子和磷脂酶，從而提高內皮細胞的通透性。

3閉合蛋白Occludin與畜禽腸道營養調控

3.1抗營養因子與閉合蛋白Occludin

大豆凝集素（SBA）是大豆抗營養因子中重要的一種，影響動物的腸道結構和功能，從而降低了動物對大豆蛋白的利用效率。SBA會顯著性降低細胞間緊密連接occludin和claudin-3蛋白的相對表達量，降低腸道的機械屏障功能。另一研究表明：隨大豆球蛋白濃度逐漸升高，仔豬小腸上皮細胞緊密連接蛋白Z0～1和閉合蛋白Occludin mRNA相對表達量均呈下降趨勢。

3.2斷奶應對閉合蛋白Occludin 表達的影響

仔豬早期斷奶應激會引起小腸絨毛高度下降，隱窩深度加深，對斷奶仔豬小腸形態造成損傷。仔豬早期斷奶后腸上皮細胞緊密連接蛋白閉合蛋白Occludin mRNA相對表達量明顯下降，至35日齡時雖有所恢復，但仍然低于斷奶前表達水平。閉合蛋白Occludin一旦進入緊密連接，其連接部位的膜通透性降低，僅允許小分子出入，而大分子難以進出。它的存在決定腸道選擇性屏障，一旦發生變異、減少和缺失可以引起腸上皮細胞間隙通透性增加，細菌內毒素等大分子物質可透過緊密連接進入體循環。早期斷奶后仔豬腸道的通透性增加，腸屏障功能破壞，可能歸因于腸上皮細胞緊密連接蛋白閉合蛋白Occludin mRNA表達下降。

3.3針對閉合蛋白Occludin的影響

在維持動物胃腸道上皮屏障的功能完整性上，鋅的作用已被廣泛報道，由于鋅的缺乏會導致緊密連接的改變，其對閉合蛋白Occludin也有一定的影響。高劑量氧化鋅對腸屏障的保護作用并不是通過改變腸道菌群結構，而是通過抑制細菌在腸道黏膜的黏附，阻止上皮細胞滲透性的增加來實現的。以產腸毒素型埃希氏大腸桿菌（ETEC，K88）所導致的受損Caco-2細胞系作為模型，研究氧化鋅對受損細胞的保護作用。結果表明，高劑量氧化鋅增加了培養細胞系的細胞緊密連接滲透性，氧化鋅可以阻止黏膜完整性遭到破壞。胡彩虹等的研究表明，高鋅可以調節腸上皮細胞緊密連接蛋白閉合蛋白Occludin和ZO-l的表達，同時指出高鋅影響閉合蛋白Occludin和ZO-l基因表達的作用是通過維護腸黏膜功能，減少細菌和內毒素通透和其對某些細胞因子的調控產生作用實現的。

3.4微生態劑對閉合蛋白Occludin的影響

目前認為腸道致病菌影響緊密連接功能的途徑：（1）改變宿主細胞緊密連接蛋白結構及功能；（2）破壞細胞骨架結構；（3）影響其他細胞信號通路，如PKC途徑等。姜偉煒等的研究顯示，大腸桿菌黏附于腸道上皮細胞后，可分泌效應分子，并通過各種途徑作用于細胞，引起腸黏膜功能紊亂，如電解質分泌紊亂，緊密連接屏障被破壞，細菌異位感染等，或誘導細胞凋亡。在陳德龍等的試驗結果中表明，在LAB1模擬治療S.cho和E.coli感染的試驗中，閉合蛋白Occludin的表達量與LAB1濃度有很強的正濃度效應，和S.cho與E.coli感染量呈負濃度效應。同時，Shin等的研究中發現，腸道致病性大腸桿菌可使閉合蛋白Occludin去磷酸化，導致閉合蛋白Occludin位置改變，跨膜電阻值降低。

抗菌肽，又稱微生物肽，是一類具有抗菌、抗病毒活性的小分子多肽。在豬的空腸上皮細胞培養液中加入抗菌肽培養24小時，發現含5.0ug/mL以上的抗菌肽的培養基中，閉合蛋白Occludin基因相對表達量有上升趨勢。有研究表明腸上皮細胞緊密連接蛋白的基因表達與腸道細菌的代謝產物（如磷壁酸、丁酸等）有關。因此，抗菌肽可維持腸道微生態平衡，提高腸粘膜免疫力，間接促進閉合但的基因表達。

3.5谷氨酰胺對閉合蛋白Occludin的影響

谷氨酰胺（glutamine，Gln）是胃腸道管腔細胞的基本能量來源，是腸道粘膜細胞代謝必需的營養物質，對維持腸道粘膜上皮結構的完整性起著十分重要的作用。已有研究報道在腸細胞培養液中抑制谷氨酰胺合酶活性或不添加谷氨酰胺時，甘露醇滲透性增加，跨上皮電阻抗值下降，從而減少閉合蛋白Occludin表達并擾亂其分布，引起腸道屏障功能的損傷。近年研究表明，信號通路ERK和NF-κB與調控閉合蛋白修復腸道屏障損傷有關。

4小結

黏膜屏障是腸道重要的屏障之一，其由上皮細胞以及細胞間的眾多連接所構成如緊密連接、縫隙連接（gapjunction，GJ）、點附連接（adherencejunction，AJ）以及橋粒（desmosome）等。緊密連接主要位于細胞頂端表面，是上皮細胞間連接最為重要的結構復合物，在維持腸粘膜的屏障功能方面發揮重要的作用，閉合蛋白Occludin對維持上皮細胞極性，形成機體滲透屏障具有重要的作用。雖然關于閉合蛋白結構、功能和調控機制已經進行了部分的研究，但是從營養的角度，研究食物或飼料中某種物質對機體閉合蛋白結構和表達等方面的影響可以為深入揭示閉合蛋白功能提供數據支持，并且從生理、病例變化中研究其結構的改變，為研究閉合蛋白Occludin在調控動物腸道營養中的應用提供重要的理論基礎。