金鐵鎖對膝關節骨性關節炎兔關節軟骨的保護作用及其機制

王勝民，劉毅，劉曉麗，熊華章，李豫皖，余峰

(1 遵義醫學院附屬醫院，貴州遵義563000；2 遵義市第一人民醫院;3 仁懷市人民醫院)

·基礎研究·

金鐵鎖對膝關節骨性關節炎兔關節軟骨的保護作用及其機制

王勝民1，劉毅1，劉曉麗2，熊華章1，李豫皖1，余峰3

(1 遵義醫學院附屬醫院，貴州遵義563000；2 遵義市第一人民醫院;3 仁懷市人民醫院)

目的 觀察金鐵鎖對膝關節骨性關節炎(OA)兔關節軟骨的保護作用，并探討其作用機制。方法 將50只家兔隨機分為空白對照組，金鐵鎖大、中、小劑量組和模型對照組，各10只。除空白對照組外，其余各組均按照改良Hulth法制備右膝關節OA模型。金鐵鎖大、中、小劑量組術后分別按體質量稱取金鐵鎖粉末12.80、4.23、2.58 mg/kg，配制藥物溶液10 mL灌胃，空白對照組及模型對照組灌服等量生理鹽水，1次/d，連用8周。造模第8周處死家兔，取右膝股骨內側髁組織，采用Mankin評分標準評價關節軟骨退變情況，qRT-PCR法檢測關節軟骨組織IL-1β、IL-6、TNF-α mRNA相對表達量。結果 空白對照組，金鐵鎖大、中、小劑量組和模型對照組Mankin評分分別為(0.80±0.20)、(2.60±0.16)、(3.40±0.16)、(5.10±0.38)、(10.40±0.16)分，各組Mankin評分依次升高，組間兩兩比較均有統計學差異(P均<0.01)。模型對照組軟骨組織IL-6、TNF-α mRNA相對表達量均高于其余各組，空白對照組均低于其余各組，金鐵鎖大、中劑量組均低于金鐵鎖小劑量組(P均<0.05)。模型對照組軟骨組織IL-1β mRNA相對表達量均高于其余各組，空白對照組、金鐵鎖大劑量組均低于金鐵鎖中、小劑量組(P均<0.05)。結論 金鐵鎖對膝關節OA兔的軟骨具有保護作用，且呈濃度依賴性，機制可能與降低軟骨組織IL-1β、IL-6、TNF-α表達有關。

骨性關節炎；膝關節；金鐵鎖；關節軟骨；兔

金鐵鎖具有消癰排膿、止血、散瘀定痛等功效，主要用于治療跌打損傷、創傷出血等[1, 2]。目前對金鐵鎖的研究大多為其化學成分、藥理作用等方面，關于其對骨性關節炎(OA)的治療作用少見報道。2015年1～8月，我們觀察了金鐵鎖對膝關節OA兔關節軟骨的保護作用，并探討其機制。現報告如下。

1 材料與方法

1.1 材料 清潔級健康成年家兔50只，體質量2.0～2.5 kg，雌雄不限，由遵義醫學院動物實驗基地養殖場提供。10%中性緩沖甲醛固定液(即用型)購于廣州維格斯生物科技有限公司，動物組織/細胞總RNA提取試劑盒(離心柱型)購于北京莊盟國際生物基因科技有限公司，逆轉錄試劑盒(PrimeScriptTMRT Reagent Kit)購于日本TaKaRa公司，實時熒光定量PCR試劑盒(SYBR Premix Ex TaqTMⅡ)購于日本TaKaRa公司；金鐵鎖粉末購于貴州益佰制藥股份有限公司。E200型顯微鏡購于日本Nikon公司。

1.2 造模與分組處理 將50只家兔隨機分為空白對照組，金鐵鎖大、中、小劑量組和模型對照組，各10只。采用改良Hulth法[3, 4]制備兔右膝關節OA模型：耳緣靜脈注射3%戊巴比妥鈉30 mg/kg，術區備皮，常規消毒。行右膝正中切口，逐層切開，暴露右膝關節腔；切除前交叉韌帶及內側半月板，行抽屜試驗確認前交叉韌帶已完全斷裂，縫合關節腔及皮膚。空白對照組僅切開右膝關節，不切除前交叉韌帶以及內側半月板。各組術后肌注青霉素鈉20萬U/kg，連用7 d。分籠飼養并每日驅趕。按照《藥理實驗方法學》中的方法計算給藥劑量[5]，金鐵鎖大、中、小劑量組分別按體質量稱取金鐵鎖粉末12.80、4.23、2.58 mg/kg，配制藥物溶液10 mL，于造模當日灌胃給藥；空白對照組及模型對照組灌服等量的生理鹽水；1次/d，連用8周。

1.3 右膝關節大體觀察及標本制作 各組造模第8周，采用空氣栓塞法[6]處死所有家兔，取其右膝股骨內側髁，生理鹽水沖洗干凈，肉眼觀察關節軟骨的完整性及色澤。將標本分為兩份，分別采用10%甲醛及液氮(-196 ℃)進行固定。

1.4 關節軟骨退變情況觀察 HE染色[7]：取1.3中甲醛固定的右膝股骨內側髁標本，脫鈣后常規脫水，取關節軟骨石蠟包埋，5 μm厚度切片。二甲苯脫蠟，梯度乙醇水化后行Harris蘇木精染色，水洗及鹽酸乙醇分化，水洗藍化，伊紅染色。梯度乙醇脫水，二甲苯透明，中性樹膠封片，顯微鏡下觀察關節軟骨結構及軟骨細胞數量。番紅染色[8]：取1.3中甲醛固定的右膝股骨內側髁標本，脫鈣后石蠟包埋切片，二甲苯脫蠟，梯度乙醇水化后行番紅染色。水洗及梯度乙醇水化，二甲苯透明，中性樹膠封片，顯微鏡下觀察關節軟骨基質染色及潮線變化。各組染色后采用Mankin評分標準評價關節軟骨退變情況，評分越高說明關節軟骨退變越嚴重。

1.5 關節軟骨組織IL-1β、IL-6、TNF-α mRNA相對表達量檢測 采用qRT-PCR法。取1.3中液氮固定的右膝股骨內側髁標本，在液氮環境下用無菌刀片剝離關節軟骨50 mg；放于RNase free的離心管中，超聲破碎儀充分破碎，裂解、離心后取水相層。參照試劑盒說明書提取標本總RNA，紫外分光光度計檢測其濃度和純度；以總RNA為模板，于冰上配制逆轉錄反應液，將mRNA逆轉錄為cDNA。以β-actin為內參進行qRT-PCR反應，嚴格按照SYBR Green qPCR Master Mix試劑盒說明書進行操作。引物序列見表1。反應體系20.0 μL：ddH2O 6.4 μL，SYBR 10.0 μL，cDNA 2.0 μL，上、下游引物各0.8 μL。反應條件：95 ℃預變性30 s；95 ℃變性10 s；60 ℃退火30 s，共40個循環。以2-ΔΔCt法計算TNF-α、 IL-1β、IL-6 mRNA的相對表達量[9，10]。

表1 IL-1β、IL-6、TNF-α及β-actin引物序列

2 結果

2.1 右膝關節情況 空白對照組右膝股骨內側髁關節軟骨透明，表面光滑、平整，無骨贅形成。金鐵鎖大劑量組右膝關節表面失去光澤，股骨內側髁兩側無骨贅形成。金鐵鎖中劑量組右膝關節稍腫脹，色澤稍灰暗，表面欠光滑。金鐵鎖小劑量組右膝關節腫大，色澤灰暗，表面粗糙，股骨內側髁兩側骨贅形成。模型對照組右膝關節腫脹明顯，表面粗糙明顯，關節面不平，部分軟骨剝脫并顯露軟骨下骨，股骨內側髁兩側骨贅形成。

2.2 關節軟骨退變情況 空白對照組HE染色示軟骨結構光整，細胞數量正常；番紅染色示基質染色正常，潮線完整。金鐵鎖大劑量組HE染色示軟骨表面局部見不規則裂隙，軟骨細胞數量正常；番紅染色示基質局部輕度減退，潮線完整。中劑量組HE染色示軟骨表面局部見裂隙，軟骨細胞數量正常；番紅染色示基質輕度減退，潮線完整。金鐵鎖小劑量組HE染色示軟骨表面有不規則裂隙，軟骨細胞數量減少；番紅染色示基質輕度或中度減退，潮線完整。模型對照組HE染色示軟骨表面有不規則裂隙，軟骨細胞數量明顯減少；番紅染色示基質中度或重度減退，多重潮線。見插頁Ⅲ圖5、6。空白對照組，金鐵鎖大、中、小劑量組和模型對照組Mankin評分分別為(0.80±0.20)、(2.60±0.16)、(3.40±0.16)、(5.10±0.38)、(10.40±0.16)分，多組間比較有統計學差異(P<0.01)；各組Mankin評分依次升高，組間兩兩比較均有統計學差異(P均<0.01)。

2.3 各組關節軟骨組織IL-1β、IL-6、TNF-α mRNA相對表達量比較 模型對照組軟骨組織IL-6、TNF-α mRNA相對表達量均高于其余各組，空白對照組均低于其余各組，金鐵鎖大、中劑量組均低于金鐵鎖小劑量組(P均<0.05)。模型對照組軟骨組織IL-1β mRNA相對表達量均高于其余各組，空白對照組、金鐵鎖大劑量組均低于金鐵鎖中、小劑量組(P均<0.05)。見表2。

表2 各組關節軟骨組織IL-1β、IL-6、TNF-α mRNA相對表達量比較

注：與空白對照組比較，aP<0.05；與金鐵鎖大劑量組比較，bP<0.05；與金鐵鎖中劑量組比較，cP<0.05；與金鐵鎖小劑量組比較，dP<0.05。

3 討論

OA是一種以關節軟骨變形和丟失，關節邊緣和軟骨下骨骨質再生為特征的慢性關節疾病[11]。關節軟骨由軟骨細胞和細胞外基質構成，軟骨基質主要由膠原纖維、蛋白多糖和水組成，上述成分結合使關節軟骨具有承受負荷、抵抗應力及減少摩擦等作用，OA的始發部位就在關節軟骨。為創建合理的關節軟骨缺損動物模型，本研究采用了改良Hulth法。結果顯示，造模第8周空白對照組關節軟骨光滑，無骨贅形成，基質染色正常，潮線完整；模型對照組關節軟骨見不規則裂隙，細胞數目減少，潮線不完整，基質染色失染；提示造模成功。本研究中，空白對照組、金鐵鎖大劑量組、金鐵鎖中劑量組、金鐵鎖小劑量組和模型對照組Mankin評分依次升高，且組間兩兩比較均有統計學差異；不僅說明本研究造模成功，亦表明金鐵鎖對膝關節OA兔具有軟骨保護作用，且呈濃度依賴性。

IL-1β是OA發病過程中的一種重要炎癥因子，可通過一系列級聯反應引起關節的破壞和炎癥反應[12]。IL-1β對膝關節OA的影響很復雜，主要是從改變軟骨細胞正常結構與功能，促進軟骨細胞凋亡發生，降解軟骨細胞基質等多方面發揮作用，其軟骨組織的中上層軟骨細胞及其基質皆呈IL-1強陽性反應[13]。TNF-α參與介導多種炎癥過程，OA的發病與關節滑膜細胞增殖旺盛并分泌過多的TNF-α有關[14]。TNF-α可以激活并聚集白細胞，增強白細胞吞噬功能，從而參與感染和自身免疫性疾病的調節[15]。

IL-6可能是TNF-α和IL-1β作用于其他細胞的中介物質，三者協同作用可加速OA的進展[16，17]。IL-6可刺激正常軟骨、滑膜細胞產生前列腺素和膠原酶，增加關節炎性反應和由IL-1介導的基質金屬蛋白酶的分泌。研究表明，IL-6能夠促進OA患者關節軟骨細胞生成IL-1受體拮抗劑、可溶性TNF受體等，從而減輕關節組織的炎癥反應[18]。本研究中，模型對照組軟骨組織IL-1β、IL-6、TNF-α mRNA相對表達量均明顯高于其余各組，而金鐵鎖大、中劑量組軟骨組織IL-6、TNF-α mRNA相對表達量均明顯低于金鐵鎖小劑量組，金鐵鎖大劑量組軟骨組織IL-1β mRNA相對表達量均明顯低于金鐵鎖中、小劑量組，說明金鐵鎖對膝關節OA兔關節軟骨的保護作用可能與其降低上述炎性因子表達有關，并呈濃度依賴性。

綜上所述，金鐵鎖對膝關節OA兔的關節軟骨具有保護作用，且呈濃度依賴性，機制可能與降低軟骨組織IL-1β、IL-6、TNF-α表達有關。但是關于金鐵鎖對膝關節OA軟骨保護的其他作用機制仍需進一步研究。

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貴州省科技廳社發攻關基金資助項目(黔科合SY[2010]3091號)；遵義醫學院附屬醫院碩士啟動基金項目(院字[2013]20號)。

劉毅(E-mail： 13308529536@163.com)

10.3969/j.issn.1002-266X.2016.16.008

R684.3

A

1002-266X(2016)16-0027-03

2015-11-10)