《中華人民共和國藥典（2015年版）》（四部）中微生物檢驗相關通則的增、修訂情況介紹

馮震+范一靈+楊美成

摘 要 目的：介紹《中華人民共和國藥典（2015年版）》（四部）中微生物檢驗相關通則的主要增、修訂情況。方法：比較本版和前版藥典相關內容的主要差異。結果：本版藥典中微生物檢驗相關通則體現了新的檢驗理念，在檢驗技術、檢驗方法、環境設施、培養體系和質量管理等方面均進行了增、修訂。結論：本版藥典中微生物檢驗相關通則更趨完善，已與國際全面接軌。

關鍵詞 《中華人民共和國藥典（2015年版）》 微生物檢驗 通則 增、修訂

中圖分類號：R921.2 文獻標識碼：C 文章編號：1006-1533（2016）07-0011-05

An introduction to the revision of microbiological test in the general principle of the Pharmacopoeia of the Peoples Republic of China （2015 version） volume IV

FENG Zhen*， FAN Yiling， YANG Meicheng**

（Division of Antibiotics， Shanghai Institute for Food and Drug Control， Shanghai 201203， China）

ABSTRACT Objective： To systematically introduce major supplement and revision in the general principle of the Pharmacopoeia of the Peoples Republic of China （Chinese Pharmacopoeia） （2015 version） volume IV. Methods： The main differences between Chinese Pharmacopoeia （2010 version） and Chinese Pharmacopoeia （2015 version） were compared. Results： New ideas in microbiological test were established in Chinese Pharmacopoeia （2015 version）， and supplement and updating amendment were carried out in testing technology and methods， environmental facilities， culture media and quality management. Conclusion： The general principle related to microbiological test in Chinese Pharmacopoeia （2015 version） is tending to be perfect and has achieved the international pharmaceutical standard.

KEY WORDS Pharmacopoeia of the Peoples Republic of China （2015 version）； microbiological testing； general principle； revision

微生物污染是影響藥品質量和安全性的主要因素之一。《中華人民共和國藥典（2015年版）》（以下簡稱為“2015年版《中國藥典》”）已自2015年12月1日起正式實施，其中的微生物檢驗相關通則實現了全藥典的統一，形成了比較完備的藥品微生物檢驗標準體系。2015年版《中國藥典》（四部）中的微生物檢驗相關通則已與國際全面接軌，在多個方面與主要發達國家藥典保持了協調一致，對藥品中污染菌的控制、殺滅、檢出、鑒定以及微生物檢驗的環境控制、實驗室質量管理等均作出了更明確的要求和說明。2015年版《中國藥典》（四部）中微生物檢驗相關通則的增、修訂體現了近年來我國藥品微生物檢驗領域的新理念、新方法和新技術，現將此部分的主要增、修訂情況介紹如下。

1 微生物檢驗新理念

2015年版《中國藥典》（四部）中微生物檢驗相關通則的總體要求體現了新的檢驗理念。由于藥品中微生物污染的來源復雜且存在不均勻性，故本版藥典規定無菌、微生物限度的檢查結果為不符合規定時不得復試，僅在充分證明試驗結果無效后方可重試；同時，強調不僅需要關注檢驗方法本身，還應重視菌種管理、控制菌鑒定、環境設施及性能、培養基質量控制和實驗室生物安全性等多個方面，以保證每次檢驗結果的準確、可靠。因為有限數量的檢驗樣品情況不能代表整批藥品的情況，所以無菌、微生物限度等的檢驗結果并不能完全反映全部藥品的實際微生物污染情況。鑒于此，2015年版《中國藥典》微生物檢驗標準體系致力于推動藥品微生物檢驗實驗室從簡單的終產品檢驗實驗室向微生物風險調查分析型實驗室方向發展。

2 微生物檢驗相關通則的基本情況

2015年版《中國藥典》（四部）中的微生物檢驗相關通則較前版藥典相關附錄有較大的變化，其中新增了4則通則、修訂了6則，僅3則通則未作修訂。增、修訂后，微生物檢驗相關通則總數達13則（表1）。

3 增、修訂情況

下面簡要介紹本版藥典中微生物檢驗相關通則的增、修訂情況，其中對藥品檢驗工作中最為常用的無菌和微生物限度這兩個檢查項目所涉及的通則進行相對較為詳細的論述。

3.1 無菌檢查法

我國藥典中的無菌檢查法自1953年引入直接接種法至今已有63年的歷史，將薄膜過濾法明確為無菌檢查的首選方法也已有15年的歷史，無菌檢查技術已趨成熟。2005年后，我國藥典在不斷完善檢驗方法要求的基礎上，逐漸建立起一個可控、可追溯的無菌藥品檢驗體系。2015年版《中國藥典》中的無菌檢查法在實驗環境、培養體系和質量控制等很多方面作了重大的調整和修訂。

3.1.1 實驗環境

避免微生物污染是無菌檢查的首要條件，本版藥典首次與2010年版《藥品生產質量管理規范》中的潔凈環境要求相銜接，將實驗環境的潔凈度級別分為A、B、C、D 4個等級。本版藥典在編號為“9203”的通則中給出了無菌檢查環境的指導性要求，即應在B級背景下的A級單向流潔凈區或隔離系統中進行實驗，強化了無菌檢查過程中對環境的動態潔凈度控制要求。

3.1.2 培養體系

在本版藥典前，我國藥品微生物檢驗領域普遍將微生物分為細菌和真菌兩類，其中細菌接種于硫乙醇酸鹽流體培養基（fluid thioglycollate medium， FTM），真菌接種于改良的馬丁培養基。事實上，許多細菌和真菌在上述兩種培養基中都能很好地生長和繁殖，而FTM的獨特之處在于它可提供一種厭氧培養條件。在本版藥典中，微生物的分類更多地依據其對營養物質的需求（尤其是對氧氣的需求），這種分類方法更為合理和嚴謹。在微生物分類方法變化的基礎上，為了與國際接軌，本版藥典還采用胰酪大豆胨液體培養基替代改良的馬丁培養基，并在培養基、方法適用性試驗和供試品檢查等部分作了相應的調整。例如，在培養及適用性試驗中，金黃色葡萄球菌、銅綠假單胞菌和生孢梭菌接種于FTM后置于30 ～ 35 ℃下培養，枯草芽孢桿菌、白假絲酵母和黑曲霉接種于胰酪大豆胨液體培養基后置于20 ～ 25 ℃下培養，均延長觀察時間至5 d。

3.1.3 供試品檢查內容

本版與前版藥典均強調無菌檢查法的合理性和有效性，其中本版藥典采用“方法適用性”替代“方法驗證”，表述更為準確。在檢驗量和檢驗數量的定義上，本版藥典根據國際通行的方法，按劑型和用途作了重新編排。同時，將前版藥典中有關生物制品的內容進行了整合。在實驗操作上，也明確了生物制品需要接種于2份FTM并分別置于30 ～ 35 ℃和20 ～ 25 ℃下進行培養、觀察，以降低漏檢風險。

3.1.4 風險評估和偏差調查的要求

本版藥典倡導和強調了無菌檢查過程中的污染風險評估和結果偏差調查體系建設的重要性。要充分理解本版藥典無菌檢查法的變化，不僅需要研讀編號為“1101”通則自身的變化，而且還要結合編號為“9200”的通則，從現代化、規范化和國際化的微生物實驗室質量管理角度出發，全面提高檢驗結論的可信度，重新審視無菌檢查全過程中的風險管理和質量控制體系，緊跟本版藥典指導理念的變化。

3.2 微生物限度檢查法

2015年版《中國藥典》中的微生物限度檢查部分由原藥典各部相應附錄整合而成，包含編號為“1105”、“1106”和“1107”的3則通則。

3.2.1 實驗環境

本版藥典在微生物限度檢查部分中并未明確規定檢驗環境的要求，而是在編號為“9203”的通則中給出了具體指導意見，即微生物限度檢查應在不低于D級背景下的B級單向流空氣區域內進行。本版藥典的這一要求較之前的實驗環境要求沒有實質性的區別，并還在編號為“9205”的通則中對實驗環境菌監控的范圍和頻次給出了更詳細、更具體的指導原則，增強了方法的可操作性。

3.2.2 培養體系

微生物限度檢查計數用培養基由胰酪大豆胨瓊脂培養基、沙氏葡萄糖瓊脂培養基替代了營養瓊脂培養基、玫瑰紅鈉瓊脂培養基。控制菌檢查用培養基中，增菌培養基由胰酪大豆胨液體培養基替代了膽鹽乳糖培養基和營養肉湯培養基，并新增了沙氏葡萄糖液體培養基。大腸埃希菌檢查用培養基新增了麥康凱肉湯培養基，沙門菌檢查用培養基由RV沙門菌增菌液體培養基替代了四硫磺酸鈉亮綠培養基。此外，新增了腸道增菌液體培養基、紫紅膽鹽葡萄糖瓊脂培養基、木糖賴氨酸脫氧膽鹽瓊脂培養基等；前版藥典收載的甘露醇氯化鈉瓊脂培養基、溴化十六烷基三甲銨瓊脂培養基等，雖培養基的名稱未變，但配方中的營養成分、指示劑用量和篩選性能均有所改變。

需氧菌總數檢查時的培養溫度沒有變化，為30 ～ 35℃，培養時間為3 ～ 5 d；霉菌和酵母菌計數檢查時的培養溫度由23 ～ 28 ℃改為20 ～ 25 ℃，培養時間為5 ～ 7 d；控制菌檢查中的部分增菌培養時間有所延長，其中大腸埃希菌的培養溫度改為42 ～ 44 ℃。

3.2.3 檢查方法

3.2.3.1 微生物計數法

微生物計數法中新增了最可能數法，作為平皿法和薄膜過濾法的有效補充。最可能數法的精密度和準確度不及平皿法和薄膜過濾法，且僅能在對供試品需氧菌總數沒有適宜計數方法時使用，不適用于霉菌計數。

微生物計數方法更加嚴謹、準確，計數結果以指數方式表示，最大可接受限度值遵守2倍規則，符合微生物污染的離散型泊松分布規律，能更客觀地反映受試品中的微生物污染水平。

3.2.3.2 控制菌檢查法

控制菌檢查方法基本沒有變化，但大腸埃希菌檢查中新增了二次增菌步驟，耐膽鹽革蘭陰性菌檢查中新增了預培養步驟。對腸道菌群的檢查，修訂了檢查的名稱，另由耐膽鹽革蘭陰性菌替代大腸菌群，檢查范圍更大。

3.2.4 方法適用性試驗

計數回收試驗中需要對銅綠假單胞菌、金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌、白假絲酵母和黑曲霉進行適用性檢查，其中白假絲酵母和黑曲霉需要同時以胰酪大豆胨瓊脂培養基和沙氏葡萄糖瓊脂培養基進行計數回收試驗。試驗菌加入方式也有變化，要求將菌液加入供試液中，且所加菌液的體積不超過供試液體積的1%，使每ml供試液或每張濾膜所濾過的供試液中的含菌量<100 CFU。試驗菌加入方式的改變更能確認方法的有效性和對微生物的無毒性。

計算適用性試驗結果時，要求中和劑或滅活劑對照組的菌落數與菌液對照組菌落數的比值在0.5 ～ 2間，改變了原回收率≥70%的規定，更客觀、合理。

3.2.5 微生物限度標準

本版藥典中的微生物限度標準由原藥典各部相關附錄整合而成，并作了統一規定和合理調整：基于藥品的給藥途徑及對患者的潛在危害風險等級，對齒齦、皮膚給藥制劑，新增了大腸埃希菌、金黃色葡萄球菌和銅綠假單胞菌的檢查；對呼吸道給藥制劑，新增了耐膽鹽革蘭陰性菌的檢查；對陰道、尿道給藥制劑中含有中藥成分者，新增了梭菌的檢查；對原（輔）料、中藥提取物和中藥飲片，新增了微生物限度標準。此外，還加強了對沙門菌的控制。

本版藥典還允許根據風險評估結果增加現未收載的控制項目，對建立個性化的藥品質量標準作了原則性的規定。例如，對原（輔）料及某些特定制劑，根據其特性、生產工藝和用途等，可能還需檢查其他具有潛在危害的微生物；藥品中若檢出其他可能具有潛在危害的微生物，應從給藥途徑、藥品特性、使用方法和用藥人群等方面進行評估；微生物風險評估人員應經過微生物學和微生物數據分析等方面的專業知識培訓等。

3.3 抑菌效力檢查法

對本身不具有充分抗菌效力的藥品，應根據制劑（尤其是多劑量包裝的制劑）特性添加適宜的抑菌劑，以防止制劑在正常貯藏或使用過程中可能發生的微生物污染和繁殖、從而使制劑變質而對用藥者造成危害。所有抑菌劑都具有一定的毒性，故添加的抑菌劑的量應為最低有效量。同時，抑菌劑的抑菌效力在制劑貯藏過程中可能因受到藥品成分或包裝容器等因素的影響而發生變化，因此應驗證制劑的抑菌效力不會在效期內因貯藏條件而降低。

2015年版《中國藥典》將前版藥典的“抑菌效力檢查指導原則”修訂為“抑菌效力檢查法”，即由建議性要求變為了強制性控制要求，屬重大改變。抑菌效力檢查法用于檢測滅菌及非滅菌制劑的抑菌活性，以評價最終藥品的抑菌效力；也可用于生產企業，以指導和確定在研制劑中的抑菌劑濃度。該檢查項目是制劑開發和留樣穩定性考察時的重要檢測項目，可保證制劑中的抑菌劑為最低有效量，且在制劑效期內抑菌有效。

3.4 藥品微生物實驗室質量管理指導原則

藥品微生物檢驗受很多因素的影響，其中任何因素出現偏差都可能導致錯誤的檢驗結果。因此，實驗室管理人員和檢驗者應了解所有影響檢驗結果準確性的環節和因素，進行嚴格的全面質量管理及過程控制，并采用適宜的質量控制方式予以監控。編號為“9203”的通則涵蓋了以下幾個方面的內容：人員、培養基、試劑、菌種、環境、設備、樣品、檢驗方法、污染廢棄物處理、檢測結果質量保證、檢測過程質量控制、實驗記錄、結果的判斷、檢測報告和文件等。

需要注意的是，藥品微生物檢驗實驗室應符合國家對生物安全的相關要求，尤其是對病原微生物的分離、鑒定應在二級或以上生物安全實驗室中進行。

藥品微生物檢驗實驗室在建立、維持和改進管理體系時，宜將本指導原則與《藥品生產質量管理規范》、《檢測和校準實驗室能力的通用要求》和《實驗室資質認定評審準則》等相關規定一起作為管理體系的依據，以加強對實驗室的專業、系統和具有針對性的質量管理。

3.5 微生物鑒定指導原則

本指導原則為非無菌藥品微生物限度控制菌檢查中疑似菌的鑒定以及制藥原（輔）料、用水、中間體、終產品和環境中檢出的微生物鑒定提供了指導，并明確指出微生物的鑒定以現行版的《伯杰氏系統細菌學手冊》的鑒定結果為準。

本指導原則包括微生物的鑒定程序、方法確認和系統發育的相關內容以及溯源分析。除傳統的表型鑒定技術外，還引入了基因型鑒定技術，如核酸測序、分子雜交、多位點序列分型和核糖體分型等。本指導原則還給出了微生物鑒定確認試驗的方法及其指標，指標包括準確性、專屬性、重現性、靈敏度、陽性預測值和陰性預測值，其中最重要的是準確性和重現性。

本指導原則是本版藥典的新增內容，具有突破性的意義，將在通過對污染微生物進行鑒定、分型以確認污染來源，從而改進生產工藝、提高藥品安全性，以及完善微生物實驗室管理、保障檢驗結果準確性等方面發揮重要作用。

3.6 藥品潔凈實驗室微生物監測和控制指導原則

本指導原則用于指導藥品微生物檢驗用的潔凈室等受控環境微生物污染情況的監測和控制，以使受控環境的微生物污染風險維持在可接受的水平內。本指導原則包括人員要求、初次使用的潔凈室參數確認、微生物監測方法及頻次、監測項目及標準、警戒限及糾偏限、數據分析及偏差處理、微生物鑒定和微生物控制等內容，對不同潔凈級別區域內的浮游菌、沉降菌、接觸碟和懸浮粒子等作出了明確規定。

3.7 無菌檢查用隔離系統驗證指導原則

本指導原則是為藥典要求無菌的藥品、生物制品、原（輔）料及其他產品無菌檢查用隔離系統的驗證提供指導的。

本版藥典強調應盡可能保障無菌檢查在最接近無菌的狀態下進行，因此無菌檢查用隔離系統的無菌保障能力必須得到保證。一般來說，ISO5（接近于動態A級）的污染率可以達到<1%，而無菌隔離器的污染率可以降低至<0.1%。隔離系統的驗證是保障所需無菌環境的必要條件，在系統完成安裝驗證后應定期進行操作、完整性、滅菌、滅菌循環、內部潔凈度和儀器、儀表的驗證等。

4 結語

以上就2015年版《中國藥典》（四部）中微生物檢驗相關通則的增、修訂情況作了簡要介紹。總之，本版藥典緊跟國際先進藥典的發展趨勢，在微生物檢驗相關通則方面與國際通用標準相銜接，實現了自我革新和突破，完成了從注重檢驗結果到關注檢驗過程的重大轉變。本版藥典的實施有益于更好地提高我們的微生物檢驗相關技術能力和管理水平，從而加強藥品的質量控制，保障我國藥品的安全性和有效性。